В эпителиальных мозаиках пожилых доноров слияние с резидентными клетками может восстанавливать контроль пролиферации у потомков инвазивных клеток благодаря сохранившимся аллелям резидентных клеток. Если избирательное воздействие на слияние или эти аллели не даст эффекта при достаточной полноте выявления событий, это позволит ограничить оценку возможного вклада предполагаемого защитного механизма в исследованных условиях.
Наблюдение, которое отличает эту гипотезу
Предлагается проверка в единых условиях. Начать следует со стерильных органотипических моделей эпителиальной мозаики из одной определённой анатомической области, полученных от пожилых доноров и не содержащих иммунных клеток. В этих моделях должны прослеживаться ядерные геномы резидентных и инвазивных клеток; необходимо измерить локальные контакты, подтвердить успешное замещение клеток одного типа клетками другого и определить исходные показатели доставки питательных веществ, функциональной проницаемости и внеклеточного матрикса. Сначала в ходе прижизненного наблюдения проследить, как две жизнеспособные родительские клетки образуют одну жизнеспособную гибридную клетку, затем определить организацию ядер, фазировать родительские геномы, определить число копий и плоидность, проследить дальнейшую судьбу клетки. Исключить пары слипшихся клеток, поглощённые ядра, нерасщеплённый фагоцитированный материал, перенос метки или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и временное совпадение локализации. Количественно оценить полноту выявления событий и определить, достаточно ли частоты образования гибридов и числа потомков, появление которых удалось сдержать, для объяснения эффекта на уровне участка ткани. Если редкое событие не обнаружено, указать границу его частоты с учётом чувствительности метода. Подтверждённое слияние должно предшествовать устойчивой остановке пролиферации. Необходимая проверка зависимости от аллеля, которая сама по себе ещё недостаточна для однозначного подтверждения механизма, состоит в следующем: утрата выбранного функционального аллеля резидентной клетки в уже сформированном гибриде должна приводить к возобновлению пролиферации, а восстановление именно этого аллеля должно вновь сдерживать пролиферацию. При этом необходимо обеспечить сопоставимость плоидности и истории слияния и включить контроль общего стресса, вызванного слиянием. Изменения контрольных точек клеточного цикла, зависящие от аллеля, следует измерять, сохраняя их возможные различия между сравниваемыми группами. Использовать подходящие контрольные клетки после слияния с той же плоидностью, чтобы отделить восстановление функции за счёт аллеля от общих эффектов дополнительной ДНК или стресса, вызванного слиянием. Если аллель остаётся неизвестным, сообщать только об остановке пролиферации, связанной со слиянием. После этого проверенное воздействие, которое избирательно блокирует слияние резидентных клеток, должно уменьшать образование новых защитных гибридов и увеличивать число жизнеспособных потомков инвазивных клеток по сравнению с условиями, в которых механизм восстановлен. Это предсказание действует при сопоставимых адгезии, полярности, составе секретируемых веществ, пространственном расположении локальных контактов, интенсивности замещения клеток, доступе к питательным веществам и барьерной функции. Проверку с введением новых инвазивных клеток проводить отдельно от изучения поведения уже сформированных гибридов. Жизнеспособные резидентные клетки с остановленным делением должны сохранять лишь ту часть защиты, которая обусловлена слиянием, и только в период, когда сохраняются реальные контакты, слияние и функции зрелой ткани. Отслеживать позднюю утрату хромосом, утрату контроля над пролиферацией, вклад в функции зрелой ткани и пересечение базальной мембраны независимо от остановки пролиферации и числа клеток. Нулевой результат избирательного воздействия на слияние или аллель при достаточной чувствительности выявления событий ограничивает возможный вклад предложенного механизма в этих условиях. Общая остановка пролиферации, зависящая от плоидности, поддерживает альтернативную гипотезу стресса в гибридных клетках. Замена внеклеточного матрикса в факторном эксперименте может выявить его дополнительный вклад, в том числе вклад удерживаемых растворимых факторов, лигандов и пространственной организации. Такой результат не исключает комплементацию; основание для её исключения появляется лишь тогда, когда проверенные воздействия на слияние или аллель не дают дополнительного эффекта ни в одной из соответствующих групп с заданным матриксом. Для различения гипотез необходимы также следующие проверки. При интерпретации их результатов следует учитывать указанные ограничения. Сопоставить результаты наблюдения за судьбами клеток, абсолютный рост и соотношение клонов после колонизации в сопоставимых нормальных и опухолевых условиях, с регистрацией генотипов, воздействием на механизм и его восстановлением. Под клоном здесь понимается исходная клетка и её потомки. Отдельно проверить конкуренцию между клонами и провести последовательные измерения функций зрелой ткани и барьерной функции. Одна лишь смена знака различий в приспособленности не подтверждает ни один из исходных предполагаемых механизмов и не позволяет прогнозировать профилактический эффект в отношении рака у пожилых людей. В той же эпителиальной модели от пожилых доноров сравнить сохранение и удаление резидентных клеток при сопоставимом исходном повреждении и достаточном функциональном замещении; при возможности отдельно варьировать присутствие иммунных клеток. Отслеживать контакты резидентных и инвазивных клеток, непосредственные потери клеток, их вытеснение в базальном направлении, внеклеточный матрикс и функции зрелой ткани. Защитную роль резидентных клеток можно считать подтверждённой только в пределах измеренного вклада после проверки альтернативных гипотез, связывающих эффект с повреждением при удалении клеток. Поведение клеток в отсутствие иммунных клеток само по себе не доказывает, что иммунитет не имеет значения в живом организме. Сравнить выживание и судьбу клеток с учётом их генотипов при зарегистрированном воспалительном воздействии и в сопоставимых условиях без воспаления. Использовать функциональное воздействие и восстановление механизма, последовательно измеряя функции зрелой ткани и барьерные показатели. Онкологические исходы отслеживать отдельно в проспективном наблюдении. Предсказание устойчивости в условиях колита не позволяет заключить, что такая защита полезна при старении вне условий колита, и не означает, что резидентная клетка защищает ткань при любых условиях. В факторном эксперименте варьировать заданный химический состав и архитектуру внеклеточного матрикса, а также избирательное воздействие на сигнальные пути и их восстановление, при зарегистрированном генотипе и сопоставимых условиях восстановления ткани. Отдельно измерять фактические поперечные сшивки, локальную сигнальную активность, пересечение базальной мембраны, появление мутаций и прочность ткани в области заживления раны. Вклад внеклеточного матрикса может сочетаться со всеми четырьмя исходными механизмами. То, что введение новых мутаций не планировалось, ещё не подтверждает их отсутствие. До проверки аллелей сначала откалибровать метод выявления событий и оценить полноту их выявления, прижизненно проследить спонтанное образование одного жизнеспособного гибрида из двух родительских клеток, фазировать родительские ядерные геномы, определить число копий и проследить жизнеспособность и остановку пролиферации. Если таких событий не обнаружено, указать верхнюю границу их частоты с учётом ткани, периода наблюдения и полноты выявления событий. Отсутствие зарегистрированных событий или недостаточная чувствительность методов их выявления не позволяет установить, подтверждается ли механизм в более широкой подгруппе. Если избирательные генетические изменения совместимы с жизнеспособностью клеток, восстановление выбранной нарушенной функции до физиологического уровня должно вновь обеспечить сдерживание пролиферации, опосредованное аллелем. Проверять альтернативные гипотезы, связанные с дозой гена или сопутствующим состоянием клетки, с помощью сопоставимых контрольных условий и независимых генетических изменений. Измерять изменения контрольных точек клеточного цикла как возможные промежуточные звенья механизма, отделяя их от общего стресса, вызванного слиянием. Если избирательность воздействия, жизнеспособность или характер дефекта установить не удаётся, сообщать об остановке пролиферации, связанной с аллелем, либо о том, что механизм остаётся неустановленным. Такой результат не позволяет ни отвергнуть комплементацию, ни считать её доказанной. Оценить число новых событий образования гибридов за единицу времени. Рассчитать на одно событие контрфактическое число жизнеспособных потомков, появление которых предотвращено. Указать неопределённость оценок. Учитывать инвазивные клетки, не участвовавшие в слиянии, а также сохранение и утрату гибридов. Суммировать эти вклады на протяжении восстановления ткани и сравнить их с наблюдаемым эффектом на уровне её участка. Одно лишь устойчивое накопление гибридов с остановленной пролиферацией не объясняет защиту, обеспечиваемую постоянным образованием новых гибридов. Перед сравнением провести предварительный опыт и заранее задать период наблюдения на основании реальных локальных контактов, частоты слияния, экспрессии аллеля резидентных клеток, функций зрелой ткани и барьерной функции. Во время сравнения независимо подтвердить сохранение этих условий. Сохранение защиты за счёт слияния в этот период не позволяет предсказать достаточное восполнение клеток на протяжении месяцев и лет. Повторные циклы восстановления ткани следует наблюдать отдельно, а результат отдельного сравнения считать неопределённым, если его контрольные условия не соблюдены. Сравнить суммарное число жизнеспособных потомков инвазивных клеток, сохранение гибридов, утрату контроля над их пролиферацией и вклад в функции зрелой ткани на протяжении последовательных циклов её восстановления, отслеживая поздние изменения хромосом и фенотипа. Явно указать фактическую продолжительность наблюдения и сохраняющуюся неопределённость в отношении более поздних исходов. Ни ранняя остановка пролиферации, ни произвольно выбранный конечный срок наблюдения не подтверждают долгосрочную безопасность. Для интерпретации рассматриваемого результата требуется следующее уточнение. Число потомков инвазивной клетки, появление которых предотвращено её слиянием, представляет собой ненаблюдаемую контрфактическую величину. Произвольно выбранная инвазивная клетка, не участвовавшая в слиянии, может не соответствовать условию обменимости, поскольку вероятность слияния может зависеть от истории контактов и состояния клетки. Вывод о вкладе образования гибридов в эффект на уровне участка ткани остаётся условным и требует обоснованного сравнения клонов с сопоставимым происхождением и историей. Доли гибридов для такого вывода недостаточно. Определять границы числа потомков, появление которых предотвращено, следует на основании данных о сопоставимых исходных клонах, их контактах и состояниях до события, сочетая это с избирательным подавлением образования гибридов и восстановлением механизма. Если сопоставимость обеспечить не удаётся, сообщать о сохраняющейся неопределённости из-за отбора клеток, участвующих в слиянии, и о границах оценок по результатам анализа чувствительности. За один и тот же период совместно учитывать новые события, контрфактическое число потомков, сохранение и утрату гибридов, позднюю утрату контроля над их пролиферацией и потомков клеток, не участвовавших в слиянии. Частота событий и количественная оценка защитного эффекта не приведены.
