Как остановить стягивание кожи при заживлении?

Согласно гипотезе, для прекращения сокращения после закрытия раны необходим краткий, нелетальный импульс активности эффекторной каспазы, при котором происходит разборка уже сформированного сократительного аппарата в выживающих фибробластах. Предполагается, что активация YAP поддерживает жизнеспособность клетки и тем самым позволяет ей частично выполнить программу клеточной гибели; смена транскрипционной программы миофибробласта при этом не служит основным механизмом прекращения сокращения. В этой гипотезе натяжение внеклеточного матрикса определяет, выживет ли клетка при разборке сократительного аппарата или этот процесс перейдёт в апоптоз. Устойчивым субстратом служит сократительный аппарат, белки которого остаются нерасщеплёнными; самоподдерживающееся транскрипционное состояние эту роль не выполняет. Поэтому активация YAP в подходящий момент должна превосходить его подавление только тогда, когда она обеспечивает протеолитическую разборку сократительного аппарата без гибели клеток, клеточного старения или продолжающейся пролиферации. Такой механизм мог бы стабилизировать SPV_3, при этом потребуются независимое восстановление SPV_2 и наблюдение за SPV_10.

После этих изменений отдельная клетка должна перестать создавать тяговое усилие и оставаться в таком состоянии. Те же фибробласты должны выживать, восстанавливать подвижность и после отмены вмешательства оставаться в непролиферирующем состоянии. При генетическом подавлении участвующей в этом процессе эффекторной каспазы или замене подтверждённого субстрата на вариант, устойчивый к расщеплению, клетки должны продолжать создавать тяговое усилие, хотя транскрипционный ответ, связанный с YAP, остаётся нормальным. Импульс активности каспазы с подобранными параметрами при независимом поддержании выживания клеток должен позволять обойтись без активации YAP. Этот механизм опровергается, если расщепление отсутствует, если клетки перестают создавать тяговое усилие даже при избирательной блокаде расщепления или если эффект обусловлен гибелью клеток.

Гипотеза предсказывает следующую последовательность событий. Активация YAP вызывает кратковременный сигнал репортера активности каспаз и расщепление выявленных субстратов сократительного аппарата. Эти события предшествуют устойчивому исчезновению тягового усилия отдельной клетки. Те же фибробласты выживают, восстанавливают подвижность и после прекращения воздействия остаются непролиферирующими. Согласно гипотезе, генетическое подавление задействованной эффекторной каспазы или замена подтверждённого субстрата на устойчивый к расщеплению вариант мешает клеткам перестать создавать тяговое усилие, несмотря на нормальный транскрипционный ответ, связанный с YAP. Кратковременный импульс активности каспаз с подобранными параметрами, при независимом поддержании выживания клеток, позволяет обойтись без активации YAP. Гипотеза об этом механизме опровергается, если расщепление отсутствует, клетки по-прежнему перестают создавать тяговое усилие при избирательном блокировании расщепления или наблюдаемый эффект объясняется гибелью клеток.

Оценка разных результатов может объяснять, почему эффект белка YAP кажется изменившимся на противоположный даёт другое предсказание: В тканевых эквивалентах кожи человека с возрастными изменениями, в которых после закрытия раны отслеживают клеточные линии, активация YAP вызывает кратковременный импульс сигнала каспазного репортёра и расщепление идентифицированных белков сократительного аппарата, служащих субстратами каспазы. Эти события предшествуют устойчивому исчезновению тягового усилия отдельной клетки. Те же фибробласты выживают, восстанавливают подвижность и после прекращения воздействия остаются в непролиферирующем состоянии. Генетическое подавление активности задействованной эффекторной каспазы или замена подтверждённого субстрата вариантом, устойчивым к расщеплению, препятствует тому, чтобы клетки перестали создавать тяговое усилие, при сохранении обычного транскрипционного ответа, связанного с YAP. Калиброванный импульс активности каспазы при независимом поддержании жизнеспособности клеток позволяет клеткам перестать создавать тяговое усилие без активации YAP. Этот механизм опровергается, если расщепление отсутствует, если клетки перестают создавать тяговое усилие даже при избирательной блокаде расщепления или если эффект обусловлен гибелью клеток.

Согласно гипотезе, направление эффекта YAP после закрытия зависит от конкурирующих сочетаний транскрипционных факторов, которые определяют, какая регуляторная программа активируется при участии YAP. Предполагается, что клетка выбирает между двумя конкурирующими программами: программой сокращения с преобладающим участием TEAD-SMAD и программой восстановления и разборки структур, которую можно выявить экспериментально. Натяжение меняет соотношение оценок регуляторной активности этих программ; YAP усиливает выбранную программу. Поэтому повышение активности YAP может как поддерживать сокращение, так и способствовать его прекращению. Для этого не требуются истощение запаса кофактора, замена клеток или устойчивое бистабильное состояние. По этой гипотезе, причинный механизм определяется тем, какие регуляторные белки-партнёры занимают энхансеры в текущий момент. Если клетка вновь будет выбирать подходящую регуляторную программу, это должно стабилизировать SPV_3 при сохранении SPV_2 и предотвращении ухудшения SPV_10.

В условиях для независимой проверки, исключённых из подгонки модели, измеренные относительные оценки регуляторной активности должны предсказывать границу смены направления эффекта точнее, чем отдельно взятые натяжение или общее количество ядерного YAP. Гипотеза также предсказывает, что избирательная блокада исполнительных каспаз не препятствует успешному выходу из сократительного состояния, который происходит за счёт изменений транскрипции. Гипотеза опровергается, если воздействие на регуляторные белки-партнёры меняет экспрессию репортёрных генов, но не позволяет изменить функциональные эффекты на противоположные, или если непрерывная аддитивная модель предсказывает данные столь же точно, как предложенное правило выбора программы.

В моделях старой кожи человека после закрытия раны, при отслеживании происхождения и судьбы клеток, активация YAP вызывает кратковременный импульс сигнала каспазного репортера и расщепление идентифицированных субстратов сократительного аппарата, за которыми следует стойкая утрата тягового усилия отдельных клеток. Те же фибробласты выживают, восстанавливают подвижность и после прекращения воздействия остаются в непролиферирующем состоянии. Генетическое подавление эффекторной каспазы, участвующей в этом процессе, или замена экспериментально подтверждённого субстрата на вариант, устойчивый к расщеплению, предотвращает утрату тягового усилия при сохранении нормального транскрипционного ответа на YAP. Калиброванный импульс активности каспазы при независимом поддержании выживания клеток обеспечивает утрату тягового усилия клеток без активации YAP. Механизм отвергается, если расщепление отсутствует, клетки утрачивают тяговое усилие и при избирательной блокаде расщепления либо наблюдаемый эффект объясняется гибелью клеток.

Оценка разных результатов может объяснять, почему эффект белка YAP кажется изменившимся на противоположный даёт другое предсказание: При постоянном натяжении матрикса и сопоставимом содержании ядерного YAP избирательное привлечение транскрипционных факторов или нарушение взаимодействия между ними в конкурирующих сочетаниях меняет направление влияния YAP на тяговое усилие, длительность сокращения и подвижность области придатков на противоположное. В условиях для независимой проверки измеренные относительные оценки регуляторной активности точнее предсказывают границу смены направления эффекта, чем натяжение или общее содержание ядерного YAP по отдельности. Избирательная блокада эффекторных каспаз не препятствует успешному прекращению сокращения за счёт изменения транскрипции. Гипотеза опровергается, если воздействие на регуляторные белки-партнёры изменяет активность репортёрных генов, но не позволяет изменить направление функциональных эффектов на противоположное, либо если непрерывная аддитивная модель предсказывает данные столь же точно, как предложенное правило выбора программы.

Предполагается, что влияние YAP на безопасное прекращение сокращения меняется на противоположное в зависимости от натяжения внеклеточного матрикса. Согласно рассматриваемой гипотезе, за этой кажущейся сменой не стоит единое явление. В литературе объединены разные результаты: исчезновение alpha-SMA, предотвращение дифференцировки, выход клеток из уже сформировавшегося состояния миофибробластов, сокращение ткани, регенеративный рост и предотвращение клеточного старения. Активация YAP может улучшать некоторые из этих показателей, при этом подвижность ткани после закрытия раны может оставаться нарушенной; подавление YAP может снижать силу сокращения и независимо от этого усиливать клеточное старение. Поэтому ни активация, ни подавление YAP сами по себе не гарантируют прекращения сокращения с соблюдением всех условий, описанных в этом L3. Предлагаемая гипотеза состоит в том, что наблюдаемое расхождение обусловлено неэквивалентностью конечных показателей. Она предложена как альтернатива гипотезе о скрытом механизме, который меняет функциональный эффект YAP на противоположный, и ставит под сомнение утверждение, что активация или подавление YAP стабилизирует SPV_3.

Наблюдаемые преимущества активации исчезают, если для признания успеха в одних и тех же образцах после прекращения вмешательства требуется одновременно подтвердить прекращение активной тяги, упругое восстановление, смещение придатков кожи, отсутствие клеточного старения и то, что пролиферация не продолжается. Эту гипотезу опровергнет воспроизводимое функциональное восстановление, которое при одном уровне натяжения зависит от активации YAP, а при другом от его подавления, если в обоих случаях фибробласты выживают, а их численность не увеличивается.

После закрытия раны активация Yes-ассоциированного белка (YAP) вызывает кратковременный сигнал репортера активности каспаз и расщепление идентифицированных субстратов сократительного аппарата. Эти события предшествуют устойчивому прекращению активной тяги отдельных клеток. Те же фибробласты выживают, восстанавливают подвижность и после отмены воздействия остаются в непролиферирующем состоянии. Генетическое подавление задействованной эффекторной каспазы или замена экспериментально подтверждённого субстрата на устойчивый к расщеплению вариант препятствует прекращению генерации силы, хотя связанный с YAP транскрипционный ответ сохраняется в обычном виде. Кратковременная активация каспазы с откалиброванными параметрами позволяет обойтись без активации YAP, если выживание клеток поддерживается независимо. Этот механизм опровергается, если расщепления не происходит, если клетки сохраняют способность прекращать генерацию силы при избирательной блокаде расщепления или если эффект обусловлен гибелью клеток.

Регуляторные белки-партнёры могут определять, поддержит ли сигнал сокращение фибробластов или прекратит его даёт другое предсказание: При постоянном натяжении внеклеточного матрикса и сопоставимом содержании YAP в ядре избирательное вовлечение YAP во взаимодействия с конкурирующими транскрипционными факторами или нарушение этих взаимодействий меняет направление его влияния на активную тягу, сохранение сокращения и подвижность участков ткани с придатками кожи. В экспериментальных условиях, которые не использовали при построении модели и оставили для независимой проверки её предсказаний, измеренные относительные показатели регуляторной активности лучше предсказывают, где проходит граница, за которой направление эффекта меняется, чем отдельно взятые натяжение внеклеточного матрикса или общее содержание YAP в ядре. Избирательная блокада эффекторных каспаз не препятствует успешному выходу из сократительного состояния за счёт изменений транскрипции. Гипотеза опровергается, если изменение взаимодействий с партнёрами влияет на экспрессию репортёрных генов, но не позволяет изменить направление функциональных эффектов, либо если непрерывная аддитивная модель предсказывает данные столь же хорошо, как предложенное правило выбора.