Может ли стимуляция восстановления тканей ускорить старение?

Предварительная гипотеза HERETICAL предполагает, что при ряде условий повторная регенерация в стареющем эпителии человека может закреплять вредный клональный отбор. Предполагается, что презентация антигена вызывает гибель (делецию) эффекторных T-клеток, которые прежде сдерживали эпителиальную клеточную линию, в остальном остающуюся неавтономной. Здесь клеточная линия означает исходную эпителиальную клетку и её потомков. Необходимые исходные условия включают наличие эндогенного антигена этой клеточной линии, функционально подтверждённое аутологичное распознавание, подтверждение того, что в исходном состоянии иммунная система ограничивает выживание клеток этой линии, и выбранную для проверки популяцию антигенпрезентирующих клеток. Презентация антигена при восстановлении ткани может вызывать гибель когнатных клеток. Даже с учётом одновременной пролиферации, перераспределения и восполнения клеток их гибель может приводить к тому, что иммунный надзор останется недостаточным после прекращения регенеративных сигналов и завершения подавления иммунного ответа. Само по себе недостаточное распознавание ещё не позволяет предсказать повышенную выживаемость эпителиальных клеток: клетки-мишени должны оставаться доступными для иммунных клеток, распознаваться ими и сохранять чувствительность к уничтожению, а снятие ранее подтверждённого иммунного давления должно действительно менять их выживаемость. Остаётся возможным ранее описанное неожиданное следствие: клеточная линия может сохранять преимущество в выживании при нормальной работе собственных механизмов контроля роста и снижении среднего уровня молекулярных повреждений в ткани. Эти условия можно проверить совместно, причём заключение о нормальной работе механизмов контроля роста относится только к исследованным функциям. Восстановление утраченного иммунного надзора может устранить влияние его недостаточности на клональный отбор и при этом сохранить процессы восстановления ткани, не связанные с этим механизмом. Это возможно лишь при следующих условиях: необходимые клетки, несущие тот же антиген, сохраняются в достаточной мере, специализированные клетки ткани выполняют свои функции в достаточном объёме, а ткань сохраняет достаточную способность к последующему обновлению. Внутренняя приспособленность, обратимое нарушение иммунной функции и антигенное ускользание могут присутствовать одновременно. Чтобы связать этот механизм с ускорением старения человека, необходимо установить, что помимо увеличения клона происходит устойчивое ухудшение функций с последующим повышением уязвимости.

Экспериментально подтвердите участие выбранной популяции антигенпрезентирующих клеток в рассматриваемой презентации антигена. Сочетайте регенеративное воздействие с сохранённой, избирательно прерванной и восстановленной презентацией антигена этой популяцией. При этом сохраняйте презентацию антигена эпителиальными клетками-мишенями и измеряйте трофическую поддержку, повреждение, жизнеспособность антигенпрезентирующих клеток и воздействие, которому фактически подверглись клетки. Для восстановления презентации используйте параллельные культуры с сопоставимыми условиями индукции или новый цикл индукции с сопоставимыми условиями; эта процедура не возвращает погибшие клетки. Проследите за идентифицированными исходными когнатными клетками и их потомками, регистрируя активацию, деление, непосредственно наблюдаемую гибель и перемещение между компартментами, из которых отбирают образцы. Сопоставьте абсолютную численность клеток с числом образовавшихся, погибших, прибывших и покинувших компартмент клеток. Предусмотрите контрольные условия с презентацией антигена без стимуляции. Включите клетки с посторонней антигенной специфичностью и T-клетки, на которые действует стимул при отсутствии предполагаемого пути презентации. Основное предсказание состоит в том, что связанная с регенерацией и зависящая от презентации гибель клеток вносит вклад в последующее снижение фактической иммунной защиты. Этот вклад сохраняется после учёта размножения и восполнения клеток. Одного лишь уменьшения числа активированных клеток или клеток, образовавшихся при размножении, для подтверждения этого предсказания недостаточно. Вызванная презентацией активация может опосредовать делецию, поэтому влияние активации нельзя автоматически исключать, уравнивая группы по активации; для прямой токсичности и потери клеток, независимой от презентации, нужны отдельные контрольные условия. После подтверждённого прекращения сигнала переведите все экспериментальные группы в одинаковые условия, допускающие иммунный надзор, и проведите обмен между группами отдельно для каждого компонента: T-клеток, антигенпрезентирующих клеток и эпителия. Такой обмен позволяет определить, с каким компонентом связан устойчивый эффект, но не устанавливает механизм его возникновения. Проверьте, восстанавливается ли функция сохранившихся исходных клеток и клеток других когнатных клонотипов, и оцените результат восполнения аутологичными клетками заданного состава. Проводите эту проверку в течение периода восстановления иммунной функции, длительность которого обоснована независимо. Если по-прежнему подтверждаются исходное иммунное давление, доступность мишени и её восприимчивость к уничтожению, предсказывается, что стойкая недостаточность фактической иммунной защиты способствует выживанию эпителиальной клеточной линии. Согласно этому предсказанию, такой вклад в выживание устраняется восполнением когнатных клеток до физиологического уровня и воспроизводится при их удалении. Уравняйте группы по распределению авидности, активации, дифференцировке, предшествующим условиям хранения клеток в банке и соотношению эффекторных клеток и клеток-мишеней; включите контрольное добавление клеток с посторонней антигенной специфичностью. Восстановление функции исходных клеток свидетельствует в пользу обратимого нарушения их функции. Если после делеции фактическая иммунная защита восстанавливается, связь делеции со стойкой недостаточностью иммунного надзора в этих условиях опровергается. Различие в численности, целиком обусловленное недостаточным размножением клеток, само по себе не подтверждает делецию. Если вмешательство в презентацию с подтверждённой эффективностью не влияет на гибель клеток, это ставит под сомнение предполагаемый путь индукции делеции. Рост, сохраняющийся в отсутствие иммунного воздействия, допускает предположение о вкладе внутренней приспособленности. Для успешного восстановления необходимо, чтобы специализированные клетки ткани сразу выполняли свои функции, сохранялась целостность тканевого барьера, а при последующем повреждении заданной степени, требующем репарации, сохранялась способность ткани к обновлению.

Определите популяцию клеток, которые представляют этот антиген. Проводите стимуляцию регенерации в трёх условиях: при сохранённой, избирательно прерванной и восстановленной презентации антигена этой популяцией клеток. При этом сохраняйте презентацию антигена эпителиальными клетками-мишенями и измеряйте интенсивность поддерживающих воздействий, степень повреждения, жизнеспособность антигенпредставляющих клеток и величину фактически полученного стимулирующего воздействия. Для восстановления используйте сопоставимые параллельные культуры, в которых проводят индукцию, или новый цикл индукции в сопоставимых условиях; такая процедура не возвращает погибшие клетки. Прослеживайте исходные идентифицированные T-клетки, специфичные к этому антигену, и их потомков, регистрируя активацию, деление, непосредственно наблюдаемую гибель и перемещение между отсеками, из которых отбирают образцы. Сопоставляйте абсолютную численность клеток с числом клеток, образовавшихся при делении, погибших, прибывших и выбывших. Включите контроль презентации антигена без стимуляции, клетки с другой антигенной специфичностью и T-клетки, подвергшиеся стимуляции при отсутствии предполагаемого пути презентации. Основное предсказание состоит в том, что связанная с регенерацией и зависимая от презентации гибель клеток впоследствии снижает полноту функциональной иммунной защиты даже с учётом размножения и пополнения клеток. Одного уменьшения числа активированных или размножившихся клеток для этого вывода недостаточно. Вызванная презентацией активация может быть промежуточным звеном в механизме элиминации клеток, поэтому нельзя автоматически устранять различия между группами по активации. Для прямой токсичности и потери клеток, независимой от презентации, нужны отдельные контроли. После подтверждённого устранения сигнала поместите все группы в одинаковые условия, допускающие иммунный надзор, и независимо заменяйте T-клетки, антигенпредставляющие клетки и эпителий соответствующими компонентами из других групп. Эти замены позволяют установить, в каком компоненте сохраняется эффект, но не определяют механизм его возникновения. Проверьте восстановление функции у выживших исходных клеток, у T-клеток других клонотипов, специфичных к тому же антигену, и при пополнении аутологичными клетками с заданными характеристиками. Продолжительность наблюдения за восстановлением иммунной функции должна иметь независимое обоснование. Если по-прежнему удаётся подтвердить исходное иммунное давление, доступ к клеткам-мишеням и их чувствительность к уничтожению, предполагается, что стойкая недостаточность иммунной защиты способствует выживанию клеток-мишеней. Этот вклад недостаточной защиты в выживание мишеней можно устранить добавлением T-клеток нужной антигенной специфичности в физиологическом количестве и воспроизвести удалением таких T-клеток. Обеспечьте сопоставимость групп по распределению авидности, степени активации, состоянию дифференцировки, условиям предшествующей заготовки и хранения клеток, а также по соотношению эффекторных клеток и клеток-мишеней; включите контроль с добавлением клеток другой антигенной специфичности. Восстановление функции исходных клеток свидетельствует в пользу обратимого нарушения функции. Если после элиминации клеток полнота иммунной защиты восстанавливается, связь элиминации со стойким дефицитом защиты в этих условиях опровергается. Различие в численности, полностью объясняемое нарушением пролиферации, не доказывает элиминацию клеток. Если подтверждённое вмешательство в презентацию не влияет на гибель клеток, это ставит под сомнение предполагаемый путь её индукции. Если рост сохраняется в отсутствие иммунного воздействия, можно предположить, что внутренние свойства клеток способствуют этому росту. Для подтверждения функционального восстановления необходимы образование зрелых функциональных клеток и целостность барьера сразу после вмешательства, а также сохранение способности к обновлению при последующем восстановлении после повреждения заданной интенсивности.

Повторная регенерация может способствовать отбору клеток с большим числом копий внехромосомной ДНК с онкогеном даёт другое предсказание: Сначала установите, какой эндогенный антиген несёт исследуемая эпителиальная клеточная линия, то есть исходная эпителиальная клетка и её потомки. Подтвердите, что когнатные клетки исходно ограничивают выживание этой линии, и определите популяцию клеток, обеспечивающую презентацию антигена. Проводите стимуляцию регенерации при сохранённой, избирательно прерванной и восстановленной презентации антигена этой популяцией. При этом сохраняйте презентацию антигена эпителиальными клетками-мишенями и измеряйте трофическую поддержку, повреждение, жизнеспособность антигенпрезентирующих клеток и фактическое воздействие на клетки. Для восстановления презентации используйте сопоставимые параллельные культуры, в которых проводят индукцию, или новый сопоставимый цикл индукции; погибшие при делеции клетки при этом не восстанавливаются. Проследите у идентифицированных исходных когнатных клеток и их потомков активацию, деление, непосредственно наблюдаемую гибель и перемещение между отсеками, из которых отбирают образцы. Сопоставьте абсолютную численность клеток с появлением новых клеток, гибелью, прибытием и выбытием. Предусмотрите следующие варианты контроля: презентация антигена без стимуляции; использование клеток с другими антигенными специфичностями; стимуляция T-клеток при отсутствии предполагаемого пути презентации антигена. Основное предсказание состоит в том, что связанная с регенерацией и зависящая от презентации антигена гибель клеток вносит вклад в последующее снижение фактической иммунной защиты. Согласно этому предсказанию, вклад сохраняется после учёта размножения и восполнения клеток. Одного уменьшения числа активированных или размножившихся клеток для подтверждения этого предсказания недостаточно. Активация, вызванная презентацией антигена, может опосредовать делецию, поэтому автоматически устранять различия в активации между сравниваемыми группами нельзя; для оценки прямой токсичности и потери клеток, независимой от презентации антигена, нужны отдельные контрольные условия. После подтверждённого устранения регенеративного сигнала переведите все экспериментальные группы в одинаковые условия, допускающие иммунный надзор, и независимо друг от друга меняйте между группами T-клетки, антигенпрезентирующие клетки и эпителий. Эти замены позволяют определить, с каким компонентом связано сохранение эффекта, но не устанавливают механизм его возникновения. Задайте срок наблюдения, достаточный для восстановления иммунной функции, и обоснуйте его независимо. За этот период проверьте восстановление функции выживших исходных клеток, других когнатных клонотипов и эффект восполнения аутологичными клетками заданного состава. Если исходное иммунное давление, доступность клеток-мишеней и их чувствительность к уничтожению по-прежнему подтверждаются, предсказывается, что стойкая недостаточность фактической иммунной защиты способствует выживанию этой эпителиальной клеточной линии. Этот вклад должен устраняться при восполнении когнатных клеток до физиологического уровня и воспроизводиться при их удалении. Обеспечьте сопоставимость групп по распределению авидности, активации, дифференцировке, истории хранения клеток в банке и соотношению эффекторных клеток и клеток-мишеней; включите контрольное добавление клеток с нерелевантной антигенной специфичностью. Восстановление функции исходных клеток поддерживает гипотезу обратимого нарушения их функции. Если после делеции фактическая иммунная защита восстанавливается, связь делеции со стойкой недостаточностью иммунного надзора в этих условиях опровергается. Различие в численности, полностью объясняемое недостаточным размножением клеток, не доказывает делецию. Если вмешательство с подтверждённым влиянием на презентацию антигена не меняет гибель клеток, это ставит под сомнение предполагаемый путь индукции. Рост, сохраняющийся в отсутствие иммунного воздействия, допускает вклад внутренней приспособленности. Для подтверждения восстановления необходимы выполнение функций специализированными клетками ткани и целостность тканевого барьера сразу после вмешательства, а также сохранение обновления ткани при последующем калиброванном воздействии, требующем её восстановления.

Импульсная стимуляция регенерации может давать преимущество линиям вредных клеток, если импульсы приходятся на чувствительные фазы клеточного цикла даёт другое предсказание: Сначала подтвердите пару из эндогенного антигена и клеточной линии, исходное сдерживание этой линии когнатными клетками и участвующую в презентации популяцию антигенпрезентирующих клеток. Проводите регенеративное воздействие в условиях сохранённой, избирательно прерванной и восстановленной презентации антигена этой популяцией. При этом сохраняйте презентацию антигена эпителиальными клетками-мишенями и измеряйте трофическую поддержку, повреждение, жизнеспособность антигенпрезентирующих клеток и фактически полученное клетками в культуре регенеративное воздействие. Для восстановления презентации используйте сопоставимые параллельные культуры, в которых проводят индукцию, или новый сопоставимый цикл индукции; погибшие при делеции клетки при этом не восстанавливаются. Проследите за исходными идентифицированными когнатными клетками и их потомками, регистрируя активацию, деление, непосредственно наблюдаемую гибель и перемещение между компартментами, из которых отбирают образцы. Сопоставьте абсолютную численность клеток с числом вновь образовавшихся, погибших, прибывших и покинувших компартмент клеток. Включите контроль презентации без стимуляции, клетки с другими антигенными специфичностями и T-клетки, подвергнутые стимуляции при отсутствии предполагаемого пути презентации. Основное предсказание состоит в том, что связанная с регенерацией и зависящая от презентации гибель клеток вносит вклад в последующее снижение фактической иммунной защиты. Согласно этому предсказанию, вклад сохраняется после учёта размножения и восполнения клеток. Само по себе уменьшение числа активированных или размножившихся клеток этого предсказания не подтверждает. Вызванная презентацией активация может опосредовать делецию, поэтому различия в активации нельзя автоматически устранять при выравнивании условий сравнения. Для прямой токсичности и убыли клеток, независимой от презентации, нужны отдельные контроли. После подтверждённого прекращения сигнала приведите все экспериментальные группы к общим условиям, допускающим иммунный надзор, и независимо заменяйте T-клетки, антигенпрезентирующие клетки и эпителий соответствующими компонентами из других групп. Такие замены позволяют определить, с каким компонентом связано сохранение эффекта, но не устанавливают механизм его возникновения. Проверьте восстановление функции исходных выживших клеток, действие альтернативных когнатных клонотипов и восполнение аутологичными клетками с заранее заданными параметрами в течение периода восстановления иммунной функции, продолжительность которого обоснована независимо. Если исходное иммунное давление, доступность мишени и её чувствительность к уничтожению по-прежнему подтверждаются, ожидается, что стойкая недостаточность фактической иммунной защиты способствует выживанию клеток линии. Этот вклад можно устранить восполнением когнатных клеток до физиологического уровня и воспроизвести истощением их популяции. Обеспечьте сопоставимость распределения авидности, активации, дифференцировки и соотношения эффекторных клеток и клеток-мишеней. Предшествующие процедуры помещения клеток на хранение и условия их хранения также должны быть сопоставимы. Используйте контрольное восполнение клетками с нерелевантной антигенной специфичностью. Восстановление функции исходных клеток свидетельствует в пользу обратимой дисфункции. Если после делеции фактическая иммунная защита восстанавливается, связь делеции со стойкой недостаточностью иммунного надзора в этих условиях опровергается. Различие в численности, полностью обусловленное недостаточным размножением клеток, не подтверждает делецию. Если вмешательство с подтверждённым влиянием на презентацию не меняет гибель клеток, это ставит под сомнение предполагаемый путь индукции. Рост, сохраняющийся в отсутствие иммунного воздействия, может отчасти объясняться внутренней приспособленностью. Успешное восстановление требует, чтобы специализированные клетки ткани сразу выполняли свои функции, тканевый барьер сохранял целостность, а способность к обновлению сохранялась при последующей калиброванной нагрузке, требующей восстановления ткани.

Гипотеза перенесена из другой области, носит условный характер и эмпирически не подтверждена. Общая регенеративная стимуляция могла бы способствовать отбору вредоносной клеточной линии в стареющем эпителии человека, повышая частоту одновременных отказов двух механизмов ограничения роста, каждый из которых достаточен сам по себе, чтобы заблокировать одно и то же неоправданное вступление в клеточный цикл. Оба механизма могли бы сохраняться, но чаще одновременно допускать такое вступление при сопоставимой динамике отказов каждого из них по отдельности. Дополнительные случаи обхода обоих механизмов должны приводить к появлению потомства, которое сохраняется в популяции и причиняет вред; сами по себе деление после завершения восстановления ткани или высокая степень заполнения ткани клетками не делают вступление в клеточный цикл неоправданным. В результате восприимчивая к такой стимуляции клеточная линия могла бы увеличивать свою численность при кажущейся сохранности каждого механизма ограничения роста. Ранее зафиксированный вывод о последствиях прекращения стимуляции остаётся частным случаем, справедливым при определённых условиях: положительный отбор может прекратиться после восстановления независимой работы механизмов, если также становятся одинаковыми остальные значимые вероятности и фоновая приспособленность, совпадают судьбы потомков и то, как возникают возможности вступить в клеточный цикл. При этом достигнутая численность клеточной линии сохраняется. Сама по себе независимость работы механизмов не обеспечивает ни одного из этих равенств. Снижение частоты одновременных отказов могло бы сохранить необходимое обновление ткани и ограничить появление вредоносного потомства, однако оно также могло бы подавить необходимое восстановление ткани или снять ограничения для другой вредоносной конкурирующей клеточной линии.

Завершение необходимого восстановления ткани и восстановление её заполненности клетками лишь указывают на условия, подходящие для проверки. Чтобы подтвердить неуместность выбранного вступления в клеточный цикл, сравните последствия его разрешения и избирательной блокировки при сопоставимых исходных условиях. Вмешательство должно показать, что разрешение этого вступления приводит к тому, что ткань длительно остаётся избыточно заполненной сохраняющимися клетками, или нарушает функцию зрелых клеток с учётом обычной потребности в замещении клеток. В одной и той же клеточной линии, в группах с сопоставимым состоянием на момент принятия решения, вмешательства по факторному плану должны показать, что каждый работающий механизм ограничения роста блокирует это же событие, когда другой его допускает, а одновременное разрешение со стороны обоих механизмов позволяет ему произойти. Последовательно действующие компоненты или коррелирующие репортёры этим требованиям к устройству системы не отвечают. Отрицательный результат ограничивает применимость этой конкретной реализации; он не исключает все возможные пары механизмов ограничения роста. Затем попробуйте программируемое вмешательство, меняющее время возникновения сбоев двух механизмов относительно друг друга. Оно должно сохранять заранее заданные маргинальные распределения вероятности сбоев и длительности их эпизодов, а также временную зависимость в работе каждого механизма ограничения роста. Группы должны быть сопоставимы по значимым для проверки фазам, фактически полученному воздействию и истории до вмешательства. Вмешательство должно менять перекрытие сбоев двух механизмов во времени. Такое изменение несовместимо с полным сохранением прежней фактической последовательности состояний двух механизмов во времени. Проверьте достижимые границы вероятностей и измерьте, как часто возникают условия, позволяющие клетке совершить исследуемое вступление в клеточный цикл. Также измерьте восстановление работы контрольных точек и прямые эффекты на гибель, дифференцировку и вытеснение клеток из эпителия. Избирательное изменение частоты функционально подтверждённого обхода обоих механизмов ограничения роста должно менять число завершённых делений с вредными последствиями и численность сохраняющегося потомства в соответствии с наблюдаемой судьбой клеток. Одной ковариации показаний репортёров для этого недостаточно. Используйте полную родословную клеток и результаты на уровне ткани как основные конечные показатели, даже если приближение для мгновенной скорости окажется неприменимым. После отмены стимуляции сравните траектории изменения численности с подобранными сопоставимыми траекториями без стимуляции и измерьте итоговые скорости изменения численности с учётом прироста и потерь. Сама по себе независимость работы механизмов не позволяет заключить, что отбор отсутствует. Оцените каждую отслеживаемую конкурирующую клеточную линию, занимаемое клетками пространство, образование зрелых клеток, барьерную функцию и обновление ткани, продолжая оценку при последующем калиброванном воздействии, требующем восстановления ткани.

Проверьте, что предполагаемая популяция клеток действительно презентирует этот антиген. Проводите регенеративную стимуляцию в условиях сохранённой, избирательно прерванной и восстановленной презентации антигена этой популяцией. При этом сохраняйте презентацию антигена эпителиальными клетками-мишенями и оценивайте поддержку, степень повреждения, жизнеспособность антигенпрезентирующих клеток и фактическое воздействие стимула на исследуемые клетки. Для восстановления презентации используйте сопоставимые параллельные культуры, проходящие индукцию, или новый сопоставимый цикл индукции; погибшие клетки при этом не восстанавливаются. Проследите судьбу идентифицированных исходных Т-клеток, специфичных к этому антигену, и их потомков, регистрируя активацию, деление, непосредственно наблюдаемую гибель и перемещение между компартментами, из которых отбирают образцы. Сопоставьте абсолютную численность клеток с их образованием, гибелью, поступлением и выбытием. Предусмотрите контрольные условия с презентацией антигена без стимуляции. Включите в эксперимент Т-клетки другой специфичности, а также Т-клетки, подвергающиеся стимуляции при отсутствии предполагаемого пути презентации. Основное предсказание состоит в том, что связанная с регенерацией и зависимая от презентации гибель клеток вносит вклад в последующее снижение охвата функциональным иммунным надзором. Этот вклад сохраняется после учёта размножения и пополнения клеток. Одного уменьшения числа активированных или размножившихся клеток для этого вывода недостаточно. Вызванная презентацией активация может быть промежуточным звеном элиминации клеток, поэтому нельзя автоматически исключать различия в активации между сравниваемыми группами. Прямая токсичность и убыль клеток, независимая от презентации, требуют отдельных контрольных условий. После подтверждённого устранения сигнала поместите все экспериментальные группы в общие условия, допускающие иммунный надзор, и независимо заменяйте Т-клетки, антигенпрезентирующие клетки и эпителий компонентами из других групп. Такие замены позволяют определить, какой компонент сохраняет эффект, но не устанавливают механизм его возникновения. Проверьте, восстанавливается ли функция исходных выживших клеток и клеток других клонотипов той же антигенной специфичности. Также проверьте пополнение заранее определёнными аутологичными клетками. Проводите эти проверки в течение периода восстановления иммунной функции, длительность которого обоснована независимо. Если исходное иммунное давление, доступ к клеткам-мишеням и их чувствительность к уничтожению остаются подтверждёнными, предсказывается, что стойкий недостаточный охват иммунным надзором способствует выживанию клеток-мишеней. Этот вклад в выживание должен устраняться при добавлении Т-клеток соответствующей специфичности в физиологическом количестве и воспроизводиться при удалении таких Т-клеток. Обеспечьте сопоставимость распределения авидности, активации, дифференцировки и соотношения эффекторных клеток и клеток-мишеней. Обеспечьте также сопоставимость условий и сроков хранения клеток в банке; используйте контрольное добавление Т-клеток другой специфичности. Восстановление функции исходных клеток поддерживает гипотезу обратимого нарушения функции. Элиминация клеток с последующим восстановлением охвата иммунным надзором опровергает связь элиминации со стойким дефицитом надзора в этих условиях. Различие в численности, полностью объясняемое недостаточной пролиферацией, не доказывает элиминацию клеток. Если вмешательство в презентацию с подтверждённой эффективностью не влияет на гибель клеток, это ставит под сомнение предполагаемый путь индукции. Сохраняющийся рост в отсутствие иммунного воздействия допускает вклад собственных свойств клеток. При успешном восстановлении зрелые клетки ткани должны сразу вновь обеспечивать требуемый функциональный результат. Целостность барьера также должна восстанавливаться немедленно, а способность ткани к обновлению должна сохраняться при последующей калиброванной нагрузке, требующей восстановления ткани.

Повторная регенерация может способствовать отбору клеток с большим числом копий внехромосомной ДНК с онкогеном даёт другое предсказание: Заранее, независимо от показаний репортёров механизмов ограничения роста, определите, какое событие вступления в клеточный цикл будет изучаться, каков период наблюдения и какой функциональный критерий будет использоваться. Если дефицит восстановления устранён и заполненность ткани клетками вернулась к прежнему уровню, это лишь указывает на подходящие условия для проверки. Чтобы подтвердить, что заранее определённое событие вступления в клеточный цикл нежелательно, проведите вмешательство: при сопоставимых исходных условиях разрешение этого события по сравнению с его избирательным блокированием должно вызывать стойкое избыточное заполнение ткани сохраняющимися клетками или нарушение функции зрелых клеток с учётом обычной потребности в замещении клеток. Проведите вмешательства по факторному плану в пределах одной клеточной линии, то есть исходной клетки и её потомков. Сравниваемые группы должны находиться в сопоставимом состоянии на момент принятия решения о вступлении в клеточный цикл. Вмешательства должны показать, что каждый работающий механизм ограничения роста блокирует это же событие, когда другой его допускает, и что событие происходит, когда оба механизма его допускают. Последовательно действующие компоненты или коррелирующие показания репортёров не соответствуют такой организации механизмов. Отрицательный результат ограничивает применимость этой конкретной реализации, но не исключает все возможные пары механизмов ограничения роста. Затем попробуйте провести вмешательство, позволяющее программируемо сдвигать эпизоды отказа двух механизмов во времени относительно друг друга. При этом необходимо сохранить заранее заданные маргинальные распределения вероятности отказа и длительности эпизодов, а также временную зависимость в работе каждого механизма ограничения роста, обеспечив сопоставимость групп по соответствующим фазам, фактически полученному воздействию и истории до вмешательства. Вмешательство должно менять перекрытие эпизодов отказа двух механизмов во времени. При этом невозможно сохранить историю совместной работы механизмов полностью неизменной. Проверьте достижимые границы вероятностей и измерьте, как часто возникает возможность изучаемого вступления в клеточный цикл, как восстанавливается работа контрольной точки и как вмешательство напрямую влияет на гибель, дифференцировку и вытеснение клеток из эпителия. Избирательное изменение функционально подтверждённого обхода обоих механизмов ограничения роста должно менять число завершённых вредоносных делений и число потомков, сохраняющихся в популяции, в соответствии с наблюдаемой судьбой клеток. Одной ковариации показаний репортёров для этого недостаточно. Основными конечными точками должны служить результаты полного прослеживания клеточной родословной и исходы на уровне ткани, даже если приближение для мгновенной скорости неприменимо. После отмены стимуляции сравните траектории изменения численности с подобранными сопоставимыми траекториями без стимуляции и измерьте суммарные скорости изменения численности с учётом прироста и потерь. Независимость работы механизмов сама по себе не позволяет заключить, что отбор отсутствует. Оцените каждую отслеживаемую конкурирующую клеточную линию, состоящую из исходной клетки и её потомков, занятое клетками пространство, образование зрелых клеток, барьерную функцию и обновление ткани, продолжая наблюдение во время последующего калиброванного воздействия, требующего восстановления ткани.

Импульсная стимуляция регенерации может давать преимущество линиям вредных клеток, если импульсы приходятся на чувствительные фазы клеточного цикла даёт другое предсказание: Заранее определите, какое событие вступления клетки в клеточный цикл будет исследоваться, установите период наблюдения и функциональный критерий независимо от репортёрных показателей работы механизмов ограничения роста. Условия, в которых устранена недостаточность восстановления ткани и восстановлена её заполненность клетками, позволяют лишь перейти к дальнейшей проверке. Чтобы подтвердить, что исследуемое вступление в клеточный цикл неуместно, проведите вмешательство при сопоставимых исходных условиях. Сравните условия, в которых клетке позволяют вступить в цикл, с условиями, в которых это вступление избирательно блокируют. Покажите, что в первом случае вступление в цикл вызывает стойкое избыточное заполнение ткани сохраняющимися клетками или нарушение функции зрелых клеток; при оценке учитывайте обычную потребность в замещении клеток. В одной и той же клеточной линии, в группах с сопоставимым состоянием клеток на момент решения о вступлении в цикл, проведите факторный эксперимент с вмешательствами в работу обоих механизмов ограничения роста. Он должен показать, что каждый работающий механизм блокирует одно и то же событие, когда другой его допускает, а если оба механизма одновременно допускают это событие, оно может произойти. Последовательно действующие компоненты или коррелирующие репортёрные показатели не соответствуют такой организации механизмов. Отрицательный результат ограничивает применимость этой конкретной реализации, но не исключает все возможные пары механизмов ограничения роста. Затем попробуйте программируемое вмешательство, меняющее временное соотношение сбоев двух механизмов. Оно должно сохранять заранее заданные маргинальные распределения вероятности сбоев и длительности их эпизодов, а также временную зависимость в работе каждого механизма ограничения роста, то есть зависимость его поведения от предшествующего поведения. Группы должны быть сопоставимы по значимым для опыта фазам, фактически полученному воздействию и предыстории до вмешательства. Вмешательство должно изменить перекрытие сбоев двух механизмов во времени. При этом невозможно сохранить прежнюю совместную последовательность состояний двух механизмов во времени. Проверьте достижимые границы вероятностей и измерьте, как часто возникают условия, допускающие исследуемое вступление в цикл, как восстанавливается работа контрольных точек клеточного цикла и как вмешательство непосредственно влияет на гибель, дифференцировку и вытеснение клеток из эпителия. Избирательное изменение частоты функционально подтверждённого обхода обоих механизмов ограничения роста должно менять число завершённых вредоносных делений и численность сохраняющегося потомства в соответствии с наблюдаемыми судьбами клеток. Одной ковариации репортёрных показателей недостаточно. Используйте полную родословную клеток и тканевые исходы как основные конечные показатели, даже если приближение для мгновенной скорости оказывается неприменимым. После прекращения стимуляции сравните динамику численности клеток с её динамикой в сопоставимых условиях без стимуляции и измерьте суммарные скорости изменения численности с учётом прироста и потерь. Сама по себе независимость работы механизмов не позволяет заключить, что отбор отсутствует. Оцените каждую отслеживаемую конкурирующую клеточную линию, занимаемое клетками пространство, образование зрелого потомства, барьерную функцию и обновление ткани; продолжайте оценку при последующем калиброванном воздействии, требующем восстановления ткани.

Гипотеза SCOUT 1 основана на данных об амплификации генома в раковых клетках, применима при определённых условиях и пока эмпирически не проверена. Если в стареющей эпителиальной мозаике человека присутствует редкая клеточная линия, в клетках которой уже есть внехромосомная ДНК с онкогеном, способная к репликации, циклы регенерации могут способствовать преимущественному увеличению доли уже существующих клеток-потомков с большим числом копий этой ДНК. Естественное присутствие такой ДНК, её репликация, передача потомкам, экспрессия и причинный вклад в рост представляют собой отдельные необходимые условия. Если сохранившиеся копии поддерживают достаточную активность онкогена при существующих условиях клеточной ниши и работе контрольных механизмов, они могут обеспечивать наследуемую избыточную передачу сигналов после прекращения стимуляции. Речь идёт только о независимости от стимуляции регенерации после её прекращения. Зависимость от базовой поддержки, иммунитета и совместно действующих дефектов при этом сохраняется. Остаётся возможным ранее сформулированное неожиданное следствие гипотезы: избирательное уменьшение числа копий внехромосомной ДНК могло бы восстановить сдерживание роста, сохранив обычную регуляцию роста хромосомными генами и обновление соседних клеток. Ни снижение пролиферации, ни гибель клеточной линии сами по себе не подтверждают это следствие. Механизм применим только к ткани, содержащей такую ДНК; область его применимости включает дисплазию и рак. Пока неизвестно, насколько часто такая ДНК встречается естественным образом в обычном незлокачественном эпителии пожилых людей и какое значение этот механизм имеет для старения организма человека в целом.

Для этого сопоставьте взаимодополняющие данные о локализации, структуре и участках соединения ДНК, различая внехромосомные формы, хромосомную амплификацию и интеграцию. Отдельно подтвердите образование новых копий и их передачу при делениях. Прежде чем делать вывод об отборе уже существующих клеток-потомков с большим числом копий, подтвердите пригодность метода, который позволяет связать исходный набор копий ДНК каждой клетки с её последующей родословной. Один из предлагаемых подходов состоит в измерении набора копий ДНК в живых клетках с минимальным вмешательством. Такие измерения следует калибровать по результатам анализа структуры и числа копий ДНК в отслеживаемых клетках в конце наблюдения, а также в сопоставимых подгруппах клеток, которые изымают для разрушающего анализа. Точность, временное разрешение и отсутствие влияния метода на изучаемый процесс ещё требуется подтвердить. Сигнал репортера экспрессии нельзя приравнивать к числу копий ДНК, а набор копий ДНК одной сестринской клетки нельзя определять по другой без проверенных данных о сегрегации. Сравните группы без стимуляции, с повторной стимуляцией регенерации и после её отмены. Отслеживайте деление, выживание и сохранение клеток в ткани в зависимости от набора копий ДНК, изменения этого набора при каждом делении, новую амплификацию, резкие сокращения численности клеточной популяции и связанные генетические или регуляторные состояния. Основное предсказание состоит в том, что при стимуляции потомство идентифицируемых, уже существующих клеток-потомков с большим числом копий будет составлять большую долю всех потомков, сохранившихся в ткани, чем в отсутствие стимуляции. Дополнительные деления при неизменной приспособленности в расчёте на отдельное событие свидетельствуют об увеличении числа возможностей для отбора, действующего и в исходных условиях. Само по себе образование новых копий не доказывает отбора уже существующих клеток-потомков с большим числом копий. Если доступны только измерения в отдельных выборках, при которых клетки разрушаются, можно оценить изменения распределения клеток в популяции. Однако наследование и отбор на уровне отдельных клеток остаются неустановленными, если их не позволяет выявить независимо проверенная модель. После подтверждённой отмены стимуляции отдельно определите число сохранившихся копий и измерьте экспрессию, передачу сигналов и сохраняющийся избыточный рост, оценивая рост как в абсолютном, так и в относительном выражении. Уменьшение числа копий посредством воздействия, которое избирательно затрагивает соответствующую структурную форму внехромосомной ДНК, должно снижать их вклад в рост, если такого уменьшения удаётся достичь без повреждений, влияющих на результат, и без воздействия на интегрированные копии. Подавление активности онкогена независимым способом и восстановление его экспрессии до соответствующего уровня позволяют проверить, опосредует ли онкоген наблюдаемый эффект. Вывод ограничен достигнутой специфичностью воздействия: само по себе восстановление экспрессии не доказывает особой роли внехромосомного наследования. Если рост сохраняется после достаточно сильного и подтверждённого снижения активности онкогена, это свидетельствует в пользу других механизмов, поддерживающих рост, либо их сосуществования с проверяемым механизмом. Для подтверждения восстановления функции необходимо показать восстановление контроля роста в выживших клетках, их дифференцировку до зрелого состояния, целостность барьера и способность к последующему восстановлению ткани. Способность соседних клеток замещать утраченные клетки следует оценивать отдельно от устранения клеточной линии.

Определите популяцию клеток, которые представляют этот антиген. Проводите стимуляцию регенерации в трёх условиях: при сохранённой, избирательно прерванной и восстановленной презентации антигена этой популяцией клеток. При этом сохраняйте презентацию антигена эпителиальными клетками-мишенями и измеряйте интенсивность поддерживающих воздействий, степень повреждения, жизнеспособность антигенпредставляющих клеток и величину фактически полученного стимулирующего воздействия. Для восстановления используйте сопоставимые параллельные культуры, в которых проводят индукцию, или новый цикл индукции в сопоставимых условиях; такая процедура не возвращает погибшие клетки. Прослеживайте исходные идентифицированные T-клетки, специфичные к этому антигену, и их потомков, регистрируя активацию, деление, непосредственно наблюдаемую гибель и перемещение между отсеками, из которых отбирают образцы. Сопоставляйте абсолютную численность клеток с числом клеток, образовавшихся при делении, погибших, прибывших и выбывших. Включите контроль презентации антигена без стимуляции, клетки с другой антигенной специфичностью и T-клетки, подвергшиеся стимуляции при отсутствии предполагаемого пути презентации. Основное предсказание состоит в том, что связанная с регенерацией и зависимая от презентации гибель клеток впоследствии снижает полноту функциональной иммунной защиты даже с учётом размножения и пополнения клеток. Одного уменьшения числа активированных или размножившихся клеток для этого вывода недостаточно. Вызванная презентацией активация может быть промежуточным звеном в механизме элиминации клеток, поэтому нельзя автоматически устранять различия между группами по активации. Для прямой токсичности и потери клеток, независимой от презентации, нужны отдельные контроли. После подтверждённого устранения сигнала поместите все группы в одинаковые условия, допускающие иммунный надзор, и независимо заменяйте T-клетки, антигенпредставляющие клетки и эпителий соответствующими компонентами из других групп. Эти замены позволяют установить, в каком компоненте сохраняется эффект, но не определяют механизм его возникновения. Проверьте восстановление функции у выживших исходных клеток, у T-клеток других клонотипов, специфичных к тому же антигену, и при пополнении аутологичными клетками с заданными характеристиками. Продолжительность наблюдения за восстановлением иммунной функции должна иметь независимое обоснование. Если по-прежнему удаётся подтвердить исходное иммунное давление, доступ к клеткам-мишеням и их чувствительность к уничтожению, предполагается, что стойкая недостаточность иммунной защиты способствует выживанию клеток-мишеней. Этот вклад недостаточной защиты в выживание мишеней можно устранить добавлением T-клеток нужной антигенной специфичности в физиологическом количестве и воспроизвести удалением таких T-клеток. Обеспечьте сопоставимость групп по распределению авидности, степени активации, состоянию дифференцировки, условиям предшествующей заготовки и хранения клеток, а также по соотношению эффекторных клеток и клеток-мишеней; включите контроль с добавлением клеток другой антигенной специфичности. Восстановление функции исходных клеток свидетельствует в пользу обратимого нарушения функции. Если после элиминации клеток полнота иммунной защиты восстанавливается, связь элиминации со стойким дефицитом защиты в этих условиях опровергается. Различие в численности, полностью объясняемое нарушением пролиферации, не доказывает элиминацию клеток. Если подтверждённое вмешательство в презентацию не влияет на гибель клеток, это ставит под сомнение предполагаемый путь её индукции. Если рост сохраняется в отсутствие иммунного воздействия, можно предположить, что внутренние свойства клеток способствуют этому росту. Для подтверждения функционального восстановления необходимы образование зрелых функциональных клеток и целостность барьера сразу после вмешательства, а также сохранение способности к обновлению при последующем восстановлении после повреждения заданной интенсивности.

Регенеративные сигналы могут давать преимущество вредоносным клеточным линиям, синхронизируя сбои двух механизмов ограничения роста даёт другое предсказание: Заранее определите, какое решение о вступлении в клеточный цикл исследуется, какова длительность наблюдения и какой функциональный критерий используется. Эти определения должны быть независимы от показаний репортёров сдерживающих механизмов. Если удалось добиться достаточного восстановления ткани и восстановить её заполнение клетками, это позволяет лишь выделить условия для дальнейшей проверки. Подтвердите, что исследуемое вступление в клеточный цикл неуместно, с помощью вмешательства: если при сопоставимых исходных условиях позволить этому вступлению произойти, это должно, по сравнению с его избирательным блокированием, вызывать стойкое избыточное заполнение ткани сохраняющимися клетками или нарушение функции зрелой ткани. При этой оценке учитывайте обычную потребность в замещении клеток. В пределах одной и той же клеточной линии, то есть исходной клетки и её потомков, в группах, сопоставимых по состоянию клетки в момент принятия решения, вмешательства по факторному плану должны показать, что каждый из двух работающих сдерживающих механизмов блокирует это же событие, когда другой его допускает, и что событие может произойти, когда оба механизма одновременно его допускают. Последовательно действующие компоненты или корреляция показаний репортёров не удовлетворяют требованиям к такой организации механизмов. Отрицательный результат ограничивает выводы об этой конкретной реализации, но не исключает все возможные пары сдерживающих механизмов. Затем попытайтесь выполнить программируемое вмешательство, меняющее то, как сбои двух механизмов соотносятся во времени. При этом необходимо сохранить заранее заданные маргинальные распределения вероятности сбоя и длительности эпизодов, а также временную зависимость состояний каждого механизма. Обеспечьте сопоставимость групп по значимым фазам, фактически полученному воздействию и предшествующей вмешательству истории. Вмешательство должно менять перекрытие сбоев двух механизмов во времени; сохранить при этом одинаковые фактически реализованные совместные последовательности состояний невозможно. Проверьте достижимые границы вероятностей и измерьте, как часто возникает возможность для исследуемого события. Оцените восстановление работы контрольных точек и прямое влияние вмешательства на гибель, дифференцировку и вытеснение клеток из ткани. Избирательное изменение частоты событий, при которых оба сдерживающих механизма допускают исследуемое вступление в клеточный цикл, должно менять число завершённых делений с неблагоприятными последствиями и число клеток-потомков, сохранившихся в ткани, в соответствии с наблюдаемыми судьбами клеток. Такие события должны быть подтверждены функционально. Одной ковариации показаний репортёров недостаточно. Используйте полную родословную клеток и исходы на уровне ткани как основные конечные показатели, даже если приближение на основе мгновенных скоростей окажется неприменимым. После отмены стимуляции сравните динамику с динамикой в сопоставимых условиях без стимуляции и измерьте суммарные скорости чистого прироста. Независимость от отменённого стимула сама по себе не позволяет заключить, что отбор отсутствует. Оцените каждую отслеживаемую конкурирующую клеточную линию, то есть исходную клетку и её потомков. Измерьте занимаемое клетками пространство, образование зрелых функциональных клеток, барьерную функцию и обновление ткани. Продолжайте эти наблюдения и измерения при последующем калиброванном воздействии, требующем восстановления ткани.

Импульсная стимуляция регенерации может давать преимущество линиям вредных клеток, если импульсы приходятся на чувствительные фазы клеточного цикла даёт другое предсказание: До начала стимуляции установите, какие формы внехромосомной ДНК с онкогеном естественно присутствуют в ткани. Для этого сопоставьте взаимодополняющие данные о локализации, структуре и участках соединения ДНК, разграничив внехромосомные формы, хромосомную амплификацию и интеграцию. Отдельно подтвердите образование новых копий и их передачу при делениях. Прежде чем делать вывод об отборе уже существующих клеток-потомков с большим числом копий, проверьте достоверность метода, который позволяет связать исходный набор копий ДНК каждой клетки с последующей родословной её потомков. Один из предлагаемых подходов состоит в измерении набора копий ДНК в живых клетках с минимальным вмешательством в их состояние. Такие измерения следует калибровать по результатам анализа структуры и числа копий ДНК, проводимого по завершении наблюдения в отслеживаемых клетках и в сопоставимых подгруппах клеток, которые забирают для разрушающего анализа. Необходимо подтвердить точность и временное разрешение метода, а также отсутствие его влияния на изучаемые процессы. Показания репортера экспрессии нельзя приравнивать к числу копий ДНК, а набор копий ДНК одной сестринской клетки нельзя выводить из набора другой без проверенных данных о сегрегации. Сравните группы без стимуляции, с повторной стимуляцией регенерации и после её отмены. В каждой группе отслеживайте деление, выживание и сохранение клеток в ткани в зависимости от набора копий ДНК, изменения этого набора при каждом делении, новые события амплификации, резкие сокращения численности клеток и связанные генетические или регуляторные состояния. Основное предсказание состоит в том, что уже существующие клетки-потомки с большим числом копий, которые удаётся индивидуально отслеживать, оставят больше потомства, сохранившегося в ткани, чем без стимуляции, причём это преимущество будет связано с исходно большим числом копий. Дополнительные деления при неизменной приспособленности в расчёте на отдельное событие свидетельствуют об увеличении числа возможностей для отбора, действующего и без стимуляции. Само по себе образование новых копий не подтверждает отбор уже существующих клеток-потомков с большим числом копий. Если доступны только измерения отдельных выборок в разные моменты времени с разрушением исследуемых клеток, можно оценить перераспределение клеток в популяции. Однако непосредственное наследование копий и отбор на уровне отдельных клеток остаются неустановленными, если их не позволяет выявить независимо проверенная модель. После подтверждённой отмены стимуляции отдельно измерьте число сохранившихся копий, экспрессию, передачу сигналов и сохраняющийся избыточный рост по абсолютным и относительным показателям. Избирательное уменьшение числа копий с определённой структурой должно уменьшить их вклад в рост, если такое вмешательство удаётся провести без повреждений, влияющих на результат, и без воздействия на интегрированные копии. Подавление активности онкогена независимым способом и соответствующее восстановление его экспрессии позволяют проверить, опосредован ли эффект онкогеном. Вывод ограничен достигнутой специфичностью вмешательств: само по себе восстановление экспрессии не доказывает особой роли внехромосомного наследования. Сохранение роста после достаточного и подтверждённого снижения активности онкогена свидетельствует в пользу других факторов, поддерживающих рост, или их совместного действия с исследуемым механизмом. Для подтверждения функционального восстановления необходимо показать, что в выживших клетках вновь действуют ограничения роста, клетки дифференцируются до зрелого состояния, барьер сохраняет целостность, а ткань способна к последующему восстановлению. Способность соседних клеток замещать утраченные клетки следует оценивать отдельно от устранения клеточной линии.

Согласно SCOUT 2, эмпирически не проверенной гипотезе из хронобиологии клеточного цикла, при определённых условиях повторная импульсная стимуляция регенерации может способствовать отбору вредоносной клеточной линии в стареющем эпителии человека, если её дочерние клетки раз за разом получают импульсы в чувствительной фазе клеточного цикла и в результате дают больше потомков, завершивших деление и сохранившихся в ткани. Это возможно даже при отсутствии преимущества при непрерывном воздействии. Механизм может реализоваться через доступность рецепторов, интеграцию внутриклеточных сигналов и работу контрольных точек клеточного цикла, которые зависят от его фазы. Восстановление, зависящее от времени после предыдущего воздействия и происходящее без повторного совпадения импульсов с фазой, представляет собой отдельный механизм, который может действовать одновременно. Из гипотезы следует неожиданное, пока эмпирически не подтверждённое предсказание: изменение интервалов между импульсами при сопоставимой суммарной экспозиции может привести к смене лидирующей клеточной линии, если независимо измеренные закономерности отклика, соответствующие исследуемым условиям, предсказывают пересечение кривых отклика. Варьирование времени импульсов ослабляет вклад их совпадения с фазой только в том случае, если нарушает повторные совпадения, значимые для этого механизма; изменения в процессе восстановления могут влиять на рост независимо от них. После прекращения стимуляции вклад совпадения импульсов с фазой должен уменьшаться по мере исчезновения остаточного воздействия, завершения уже запущенных делений и угасания памяти синхронизации, значимой для этого механизма. Однако пока не установлено, как быстро этот вклад уменьшается, и полное прекращение отбора по совокупности всех механизмов не гарантировано. Достигнутая численность клеток, другие вызванные стимуляцией состояния и причинённый вред могут сохраняться. Клеточные линии, получающие преимущество, могут быть безвредными или полезными, поэтому вред, связанный со старением, сохранение базального обновления ткани и сохранение обновления ткани, нуждающейся в восстановлении, требуют отдельных доказательств.

Для первоначального построения карты отклика заранее распределите независимые камеры случайным образом по группам и назначьте каждой группе правило подачи импульсов при достижении заданной фазы клеточного цикла. Предварительно укажите исследуемый клон или правило выбора клеток и установите одинаковую продолжительность наблюдения, отсчитываемую от подачи импульса. Регистрируйте фазу каждой клетки перед импульсом и полностью прослеживайте её дальнейшую судьбу. Такое распределение позволяет установить эффект правила подачи импульсов; чтобы трактовать его как эффект определённой фазы, дополнительно требуется разграничить влияние времени ожидания, предшествующего воздействия и других различий в состоянии клеток. Дополните эти карты экспериментами, в которых время подачи импульсов случайным образом задаётся для каждой камеры, а фазы клеток варьируют естественным образом. При этом связи, выявленные с учётом фазы, сами по себе могут по-прежнему зависеть от смешивающих факторов. По возможности обеспечьте перекрытие диапазонов сочетаний фазы перед импульсом и времени после предыдущего воздействия в сопоставимых камерах. При отсутствии достаточного перекрытия или независимого вмешательства, позволяющего корректно разделить эти влияния, вклады фазы и восстановления остаются неразличимыми, даже если режим подачи импульсов причинно влияет на число сохранившихся потомков. Включайте обусловленные фазой изменения доступности рецепторов, интеграции внутриклеточных сигналов и работы контрольных точек клеточного цикла в совокупный эффект совпадения импульсов с фазой. На основании независимо оценённых откликов, связанных с фазой и восстановлением, предскажите результаты режимов повторной подачи импульсов, которые не использовались при оценке этих откликов. Затем проверьте предсказания в эпителиальных мозаиках, где клоны конкурируют в общей среде, измеряя плотность и состав клеток, потребность ткани в восстановлении, распределения характеристик клеточного цикла дочерних клеток, гибель, дифференцировку, вытеснение клеток и число сохранившихся потомков. Если целенаправленное изменение совпадения импульсов с фазой вызывает предсказанное изменение числа сохранившихся потомков, это свидетельствует в пользу механизма. При этом учитываются и эффекты, опосредованные участниками сигнальных путей. Самих по себе кратковременного всплеска синхронных делений, эффекта варьирования времени импульсов или смены относительных позиций клонов по числу сохранившихся потомков для этого недостаточно. Такая смена относительных позиций клонов предсказывается только для подтверждённых данными состояний ткани и интервалов между импульсами, при которых кривые отклика пересекаются. Данные свидетельствуют в пользу модели, учитывающей только восстановление, если эффекты режима стимуляции сохраняются без повторного совпадения импульсов с фазой, а независимая от фазы модель восстановления предсказывает причинные изменения числа сохранившихся потомков с точностью, которую позволяет эксперимент. После подтверждённого прекращения стимуляции оценивайте признаки памяти синхронизации по распределению клеток по фазам и данным клеточных родословных. В этот же период отдельно отслеживайте исчезновение сигнала, уже запущенные деления, абсолютный и относительный рост, сформированную барьерную функцию и ответ на последующее воздействие заданной интенсивности, вызывающее потребность ткани в восстановлении. Сохранение доли клона само по себе не доказывает ни сохранения памяти синхронизации, ни продолжающегося отбора.

Исследуйте сочетания регенеративного воздействия с сохранённой, избирательно прерванной и восстановленной презентацией антигена этой популяцией. При этом сохраняйте презентацию антигена эпителиальными клетками-мишенями и измеряйте поддерживающее действие, повреждение, жизнеспособность антигенпрезентирующих клеток и фактическую экспозицию. Для восстановления используйте сопоставимые параллельные культуры, в которых проводится индукция, либо новый сопоставимый цикл индукции; такое восстановление не возвращает погибшие клетки. Проследите активацию, деление, непосредственно наблюдаемую гибель и перемещение между исследуемыми компартментами у идентифицированных исходных клеток, специфичных к этому антигену, и их потомков. Проверьте, согласуются ли абсолютные количества клеток с числом образовавшихся, погибших, прибывших и выбывших клеток. Включите контрольные условия с презентацией антигена без стимуляции, клетки с другой антигенной специфичностью и T-клетки, подвергнутые стимуляции при отсутствии предполагаемого пути презентации. Основное предсказание состоит в том, что связанная с регенерацией и зависимая от презентации гибель клеток снижает последующий функциональный иммунный надзор даже после учёта размножения и пополнения клеток. Одного уменьшения числа активированных или размножившихся клеток для этого вывода недостаточно. Активация, вызванная презентацией антигена, может опосредовать гибель клеток, поэтому нельзя автоматически уравнивать экспериментальные группы по степени активации. Нужны отдельные контрольные условия для оценки прямой токсичности и потери клеток независимо от презентации. После подтверждённого исчезновения сигнала переведите все экспериментальные группы в общую среду, обеспечивающую условия для иммунного надзора, и независимо заменяйте T-клетки, антигенпрезентирующие клетки и эпителий, перенося их между группами. Такие замены позволяют определить, в каком компоненте сохраняется эффект, но не устанавливают механизм его возникновения. В течение периода восстановления иммунной функции, длительность которого обоснована независимо, проверьте, восстанавливается ли функция исходных выживших клеток. Отдельно проверьте, восстанавливается ли иммунный надзор за счёт клеток других клонотипов той же антигенной специфичности и за счёт пополнения заданными аутологичными клетками. Если исходное иммунное давление, доступ к клеткам-мишеням и их восприимчивость к уничтожению остаются подтверждёнными, предполагается, что стойкая недостаточность иммунного надзора способствует выживанию клеток-мишеней. Этот вклад в выживание должен устраняться пополнением клетками нужной антигенной специфичности в физиологических условиях и воспроизводиться удалением таких клеток. Уравняйте группы по распределению авидности, активации, дифференцировке, условиям предшествующего хранения клеток в банке и соотношению эффекторных клеток и клеток-мишеней; используйте контрольное добавление клеток с посторонней антигенной специфичностью. Восстановление иммунного надзора за счёт исходных клеток поддерживает гипотезу обратимого нарушения их функции. Гибель клеток с последующим восстановлением иммунного надзора опровергает связь этой гибели со стойким дефицитом надзора в исследуемых условиях. Различие в числе клеток, полностью обусловленное нарушением пролиферации, не доказывает их гибель. Если вмешательство в презентацию антигена с подтверждённой эффективностью не влияет на гибель клеток, это ставит под сомнение предполагаемый путь её индукции. Рост, сохраняющийся в отсутствие иммунного воздействия, может быть отчасти обусловлен собственными свойствами клеток. Чтобы считать ткань восстановленной, необходимо подтвердить образование зрелых клеток и целостность барьера непосредственно после вмешательства, а также проверить, продолжает ли ткань обновляться при последующем калиброванном воздействии, вызывающем потребность в её восстановлении.

Регенеративные сигналы могут давать преимущество вредоносным клеточным линиям, синхронизируя сбои двух механизмов ограничения роста даёт другое предсказание: Заранее определите, какое решение о вступлении в клеточный цикл будет исследоваться, как долго продлится наблюдение и какой функциональный критерий будет применяться, независимо от показаний репортёров сдерживающих механизмов. Если дефицит, требующий восстановления ткани, устранён и ткань вновь заполнена клетками, это позволяет лишь выделить условия для дальнейшей проверки. Чтобы подтвердить, что исследуемое вступление в клеточный цикл неуместно, проведите вмешательство при сопоставимых исходных условиях. Покажите, что, если клетке дают вступить в цикл, возникает устойчивое избыточное заполнение ткани сохранившимися клетками или нарушается функция зрелой ткани по сравнению с условиями, в которых это событие избирательно блокируют. При этом учитывайте обычную потребность в замещении клеток. Проведите вмешательства по факторному плану в одной и той же клеточной линии, включающей исходную клетку и её потомков. Сравниваемые группы должны быть сопоставимы по состоянию на момент принятия решения. Эти вмешательства должны показать, что каждый из двух работающих сдерживающих механизмов блокирует это же событие, когда другой допускает его, и что событие становится возможным, когда оба механизма одновременно допускают его. Последовательно действующие компоненты или корреляция показаний репортёров не подтверждают такую организацию механизмов. Отрицательный результат ограничивает применимость этой конкретной реализации, но не исключает все возможные пары сдерживающих механизмов. Затем попробуйте программируемое вмешательство, изменяющее относительное время работы двух механизмов и сохраняющее заранее заданные маргинальные распределения вероятности отказа, длительности эпизодов и временной зависимости внутри каждого сдерживающего механизма. Группы должны быть сопоставимы по значимым фазам клеточного цикла, полученной экспозиции и истории до вмешательства. Вмешательство должно изменить перекрытие отказов двух механизмов во времени; сохранить при этом одинаковые фактические последовательности состояний двух механизмов во времени невозможно. Проверьте достижимые границы вероятностей и измерьте, как часто возникают возможности для вступления в клеточный цикл. Также измерьте восстановление работы контрольных точек клеточного цикла и прямые эффекты на гибель, дифференцировку и вытеснение клеток. Определяйте обход обоих сдерживающих механизмов по функциональному критерию. Избирательное изменение такого обхода должно изменять число завершённых вредоносных делений и число сохранившихся потомков в соответствии с наблюдаемой судьбой клеток. Одной ковариации показаний репортёров недостаточно. Используйте полные клеточные родословные и исходы на уровне ткани как основные конечные показатели, даже если приближение с использованием мгновенной скорости неприменимо. После прекращения стимуляции сравните динамику с сопоставимыми траекториями без стимуляции и измерьте суммарные скорости роста с учётом потерь: независимость сама по себе не позволяет заключить, что отбор отсутствует. Оцените каждую отслеживаемую конкурирующую клеточную линию, пространственное заполнение ткани, результат обновления на зрелой стадии, барьерную функцию и обновление ткани, в том числе во время и после последующего калиброванного воздействия, вызывающего потребность в восстановлении.

Повторная регенерация может способствовать отбору клеток с большим числом копий внехромосомной ДНК с онкогеном даёт другое предсказание: До начала стимуляции установите, какие внехромосомные структуры, несущие онкоген, естественным образом присутствуют в клетках. Для этого используйте взаимодополняющие данные об их локализации, строении и участках соединения последовательностей, разграничивая внехромосомные структуры, хромосомную амплификацию и интеграцию в хромосомы. Отдельно подтвердите образование новых копий и их передачу при делениях. Прежде чем утверждать, что происходит отбор ранее существовавших потомков с большим числом копий, проверьте метод, позволяющий связать исходное число копий в каждой клетке с её последующей родословной. Один из предложенных подходов состоит в измерении числа копий в живых клетках с минимальным вмешательством. Такие измерения нужно откалибровать по результатам анализа структуры и числа копий, выполняемого в конце наблюдения в отслеживаемых клетках и в сопоставимых подгруппах клеток, которые выводят из эксперимента для разрушающего анализа. Обязательными условиями остаются подтверждённые точность, временное разрешение и отсутствие влияния метода на изучаемые процессы. Не приравнивайте показания репортера экспрессии к числу копий дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и не определяйте число копий в одной сестринской клетке по другой без проверенных данных о распределении копий при делении. Сравните группы без стимуляции, с повторной стимуляцией регенерации и после отмены стимуляции. Отслеживайте деление, выживание и сохранение клеток в ткани в зависимости от числа копий, изменения числа копий при каждом делении, появление новой амплификации, резкие сокращения численности клеток, а также генетические или регуляторные состояния, связанные с числом копий и судьбой отслеживаемых клеток. Основное предсказание состоит в том, что ранее существовавшие потомки с более высоким числом копий, которых можно индивидуально идентифицировать, будут, как правило, оставлять больше сохранившихся потомков, чем без стимуляции. Если делений становится больше, а приспособленность в расчёте на каждую возможность деления остаётся прежней, это поддерживает гипотезу об увеличении числа возможностей для отбора, действующего в исходных условиях. Само по себе образование новых копий не доказывает отбор ранее существовавших потомков с большим числом копий. Если доступны только измерения в отдельных выборках в разные моменты времени, при которых анализируемые клетки разрушаются, можно оценить изменение распределения числа копий в популяции. Однако наследование в отдельных клеточных родословных и отбор останутся неустановленными, если их не позволяет определить независимо проверенная модель. После подтверждённой отмены стимуляции отдельно измеряйте число сохранившихся копий, экспрессию, передачу сигналов и сохраняющийся избыточный рост в абсолютном выражении и относительно других клеточных линий. Избирательное снижение числа копий во внехромосомных структурах должно уменьшить их вклад в рост, если такое вмешательство удастся провести без повреждений, влияющих на результат, и без воздействия на интегрированные копии. Подавление функциональной активности онкогена независимым способом и восстановление сопоставимого уровня его экспрессии позволяют проверить, опосредован ли эффект онкогеном. Вывод ограничивается достигнутой специфичностью вмешательств: одно лишь восстановление экспрессии не доказывает особую роль внехромосомного наследования. Сохранение роста после достаточного и подтверждённого снижения функциональной активности онкогена поддерживает гипотезу об иных факторах роста или их совместном действии с изучаемым механизмом. Для подтверждения восстановления функции необходимо показать, что рост выживших клеток вновь подчиняется ограничениям, клетки достигают зрелого состояния в результате дифференцировки, барьер сохраняет целостность, а ткань способна к последующему восстановлению. Способность соседних клеток восполнять потери следует оценивать отдельно от устранения клеточной линии.