Порядок проверки гипотез и выбор ответственных за решение

5 альтернативных гипотез · 3 возможных ответа

Согласно гипотезе, при сниженной чувствительности рецептора FPR2 передача сигнала в ответ на резолвины переключается на путь с преимущественным участием β-arrestin, что усиливает выработку TGF-β1. При таком механизме введение резолвинов, способствующих разрешению воспаления, в стареющую ткань может не просто оказаться неэффективным, но и причинить вред, усилив фиброз.

В стареющих макрофагах человека с подтверждённой низкой плотностью FPR2 на поверхности обработка резолвином D1 повысит секрецию TGF-β1 по сравнению с контролем без обработки, то есть эффект будет состоять именно в повышении секреции, а не только в отсутствии её снижения. Малая интерферирующая РНК (siRNA), направленная против β-arrestin-2, заблокирует это повышение, тогда как коклюшный токсин (ингибитор Gαi) его не заблокирует. Такой результат подтвердит, что повышение секреции обусловлено передачей сигнала с преимущественным участием β-arrestin.

Согласно гипотезе, при достаточном количестве метаболического кофактора никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) фермент SIRT6 подавляет транскрипцию TGFB1, и макрофаг может способствовать разрешению воспаления, не вызывая рубцевания. С возрастом макрофаги теряют большую часть NAD+, что, по этой гипотезе, снимает подавление транскрипции TGFB1. Восполнение NAD+ должно вновь обеспечить подавление транскрипции TGFB1.

Предварительная обработка старых макрофагов человека никотинамидмононуклеотидом (NMN, 1 мМ, 48 ч) перед поляризацией по типу M2 под действием SPM снизит секрецию TGF-β1 более чем на 50% по сравнению с контролем с растворителем. Ингибитор SIRT6 OSS_128167 устранит этот эффект. Иммунопреципитация хроматина с последующей количественной полимеразной цепной реакцией (ChIP-qPCR) покажет восстановление деацетилирования H3K9 в области промотора TGFB1 в старых макрофагах после обработки NMN.

Пластик для культивирования клеток в миллион раз жёстче ткани. Согласно гипотезе, уже сама эта жёсткость вызывает перемещение механочувствительного белка YAP в ядро, где он активирует TGFB1 одновременно с программой заживления. На гелях с жёсткостью, соответствующей ткани, эта связь должна исчезнуть. Такой результат означал бы, что в живом организме она отсутствует в клеточной нише у обоих видов.

В макрофагах человека, полученных из моноцитов и поляризованных с помощью резолвина D1 на полиакриламидных гелях с жёсткостью 2 кПа, уровень TGF-β1 повысится менее чем в 2 раза относительно контрольных макрофагов, не подвергавшихся поляризации. В тех же клетках на пластике для культивирования уровень TGF-β1 повысится более чем в 5 раз относительно соответствующего контроля. При разных значениях жёсткости подложки отношение содержания YAP в ядре к его содержанию в цитоплазме будет коррелировать с количеством выделяемого TGF-β1 (r>0.7).

Согласно гипотезе, TGF-β1, фактор роста, который превращает фибробласты в клетки, формирующие рубцовую ткань, не достигает их, пока плотная околоклеточная оболочка из гиалуронана сверхвысокой молекулярной массы остаётся целой. Предполагается, что с возрастом меняется размер этой сетки, а количество TGF-β1, выделяемого макрофагом, остаётся прежним.

Гипотеза предсказывает, что в совместных культурах с эксплантатами ниш человека добавление экзогенного гиалуронана сверхвысокой молекулярной массы (ultra-HMW-HA, >6 MDa) на границе между макрофагами и фибробластами заблокирует вызванную TGF-β1 экспрессию α-гладкомышечного актина (αSMA) в фибробластах даже при максимально выраженной поляризации макрофагов в состояние M2 и высокой секреции TGF-β1. При той же концентрации TGF-β1 в присутствии низкомолекулярного гиалуронана (HA, <500 kDa) активация фибробластов будет возможна.

Согласно гипотезе, постоянное присутствие итаконата в стареющих макрофагах ниши блокирует TET2 и вызывает метилирование участка связывания IRF4 в энхансере TGFB1. В результате сигналы, способствующие разрешению воспаления, перестают стимулировать образование рубца. Тогда различие между человеком и способной к регенерации иглистой мышью Acomys объяснялось бы возрастными изменениями, а его связь с видовой принадлежностью была бы лишь кажущейся.

Бисульфитное секвенирование CpG в полусайте IRF4 энхансера TGFB1 в CD163+ макрофагах ниши, выделенных методом флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS), покажет метилирование >60% у пожилых доноров (65-75) и <10% у молодых доноров (20-30). Степень метилирования будет обратно коррелировать с секрецией TGF-β1 при стимуляции SPM в опытах по поляризации клеток вне организма.

Предложение эксперимента, его проведение и зафиксированный результат соответствуют разным этапам исследования.