Гипотезы по вопросу

Механизм. Недостаток субстрата ограничивает локальную активность поли-АДФ-рибозополимеразы PARP1 у остановившихся репликационных вилок. Предполагается, что возникающие повреждения распределяются между дочерними клетками неравномерно и связывают исход первого деления с последующей потерей самообновления.

Предсказание. Восстановление ядерного NAD+ только во время первой фазы синтеза ДНК уменьшает число дочерних клеток с недореплицированными участками и повышает эффективность регенерации после повторного повреждения. Этот эффект ослабевает при подавлении каталитической активности PARP1 и сопровождается изменением судьбы повреждённой дочерней клетки при отслеживании пар потомков.

Механизм. Недостаток NAD+ снижает активность танкираз TNKS1 и TNKS2, вследствие чего уменьшаются поли-АДФ-рибозилирование и последующая деградация ангиомотина. Накопление ангиомотина удерживает транскрипционный коактиватор YAP вне ядра и ограничивает пролиферацию.

Предсказание. При одинаковой жёсткости матрикса старые клетки с низким NAD+ накапливают ангиомотин и демонстрируют меньшую ядерную локализацию YAP. Снижение ангиомотина восстанавливает пролиферацию и регенеративный вклад этих клеток при сохраняющемся дефиците NAD+, причём эффект усиливается на более жёстком матриксе.

Механизм. Снижение активности NAD+-зависимого сиртуина SIRT7 нарушает организацию хроматина рибосомных генов при выходе из покоя. Возникающие РНК-ДНК-гибриды затрудняют транскрипцию и репликацию этих участков, ограничивая образование рибосом.

Предсказание. Направленная в ядрышко рибонуклеаза H1 уменьшает количество гибридов, восстанавливает синтез рибосомной РНК и сокращает задержку первого деления старых клеток при низком NAD+. Каталитически неактивный вариант фермента такого эффекта не даёт; одновременно увеличивается вклад клеток в восстановление мышцы.

Механизм. В сателлитных клетках в состоянии покоя накапливаются повреждённые митохондрии; для активации клеток необходимо резкое усиление митофагии, зависящее от окисленной формы никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) и SIRT3. При недостатке NAD+ сохраняются деполяризованные митохондрии, из которых через поры BAX/BAK-VDAC выходит митохондриальная ДНК (mtDNA). Это активирует сигнальный путь cGAS-STING, запускает интерфероновый ответ I типа и индуцирует p21/p16, что приводит к остановке клеточного цикла в активирующейся клетке.

Предсказание. В активирующихся сателлитных клетках старых организмов обнаруживаются цитозольная mtDNA и характерные признаки интерферонового ответа. При восполнении NAD+ признаки интерферонового ответа исчезают. Удаление Sting1 именно в сателлитных клетках или применение ингибитора STING восстанавливает регенерацию у старых организмов в той же степени, что и восполнение NAD+. Эффекты подавления STING и восполнения NAD+ не суммируются, что указывает на участие STING в этой причинной цепи на этапе, следующем за снижением уровня NAD+.

Механизм. Восстановленная форма кофактора NADH усиливает действие транскрипционного корепрессора CtBP на регуляторных участках Dll1. Предполагается, что длительное связывание CtBP подавляет повторные импульсы экспрессии DLL1 и меняет распределение клеточных судеб.

Предсказание. У старых клеток изменяется периодичность экспрессии DLL1 даже при сопоставимом среднем количестве лиганда. Воспроизведение нормальных импульсов DLL1 восстанавливает самообновление и регенерацию эффективнее, чем постоянная экспрессия с тем же суммарным количеством белка; эффект зависит от связывания CtBP с регуляторными участками Dll1.

Механизм. Снижение активности сиртуина SIRT5 повышает сукцинилирование митохондриальной изоцитратдегидрогеназы IDH2 и ограничивает образование восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH). Ослабление антиоксидантной защиты совпадает с ростом окисления мембранных липидов при активации клетки.

Предсказание. Кратковременное подавление ферроптоза в период первого метаболического перехода сохраняет больше регенеративных клонов, чем такое же воздействие позднее. Вариант IDH2 с подтверждённой устойчивостью к ингибирующему сукцинилированию воспроизводит этот эффект при низком NAD+, а подавление апоптоза обеспечивает меньшую защиту.

Механизм. Для выживания и направленной миграции после разрушения базальной мембраны активированные МСК должны самостоятельно секретировать и сшивать коллаген VI. Снижение уровня NAD+ подавляет активность SIRT5, вызывая накопление сукцинилированных остатков лизина в каталитическом домене фермента PLOD2, что нарушает гидроксилирование лизина в цепях коллагена VI, приводит к его внутриклеточной агрегации в ЭР и формированию рыхлого внеклеточного матрикса с низкой жесткостью, не способного удерживать ядерную локализацию механосенсора YAP.

Предсказание. Культивирование старых NAD+-истощенных МСК на децеллюляризованном матриксе, предварительно наработанном молодыми МСК, либо экспрессия мутанта PLOD2, устойчивого к сукцинилированию, восстановит созревание фокальных контактов α7β1-интегрина, ядерную транслокацию YAP и пролиферацию старых МСК без коррекции внутриклеточного пула NAD+.

Механизм. Покоящиеся МСК несут первичную ресничку, которая удерживает клетку в G0 через сигналинг Gli2/3 и должна быть быстро резорбирована при участии киназы Aurora A и деацетилаз HDAC6/SIRT2 для формирования центросомы митотического веретена. Снижение уровня NAD+ в старых МСК инактивирует базально-цилиарный пул SIRT2, стабилизирует микротрубочки аксонемы за счет гиперацетилирования K40 α-тубулина и препятствует резорбции реснички в ответ на факторы роста поврежденной мышцы.

Предсказание. Индуцированная генетическая абляция белка интрафлагеллярного транспорта IFT88 непосредственно в момент повреждения мышцы устранит задержку первого клеточного деления в старых или NAD+-истощенных МСК, а экспрессия неацетилируемого мутанта α-тубулина (K40R) ускорит декализацию и вход в S-фазу без изменения уровня NAD+.

Механизм. Асимметричное наследование митохондрий и цитоплазмы, содержащей NMNAT, приводит к образованию одной дочерней клетки с высоким уровнем NAD+ и другой с низким. В клетке с высоким уровнем NAD+ SIRT1/SIRT2-зависимое деацетилирование поддерживает экспрессию Pax7 и подавляет экспрессию Myog, а клетка с низким уровнем NAD+ вступает на путь дифференцировки. В старых клетках общий уровень NAD+ уже близок к пороговому, поэтому в обеих дочерних клетках он оказывается ниже уровня, необходимого для активности SIRT1, и обе вступают на путь дифференцировки.

Предсказание. Прижизненная визуализация с генетически кодируемым сенсором окисленной формы никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) показывает воспроизводимую асимметрию уровня NAD+ между дочерними клетками при делении молодых сателлитных клеток: уровни различаются более чем в 1,5 раза. У старых клеток эта асимметрия исчезает. Повышение уровня NAD+ в старых клетках восстанавливает асимметрию уровня NAD+ между двумя популяциями; при этом восстанавливается и доля дочерних клеток с высокой экспрессией Pax7 (Pax7-high). При повторных повреждениях численность сателлитных клеток сохраняется только при восстановлении асимметрии.

Механизм. В молодых МСК при выходе из покоя цитоплазматическая деацетилаза SIRT2 использует NAD+ для деацетилирования кортикального регулятора NuMA, что необходимо для его взаимодействия с комплексом LGN/Par3 на апикальном полюсе клетки и перпендикулярной ориентации веретена деления. При старении дефицит NAD+ снижает активность SIRT2, вызывая гиперацетилирование NuMA, потерю апикально-базальной полярности, равномерное распределение p38α/β MAPK между дочерними клетками и утрату способности генерировать недифференцированную дочернюю стволовую клетку.

Предсказание. Экспрессия мутантной формы NuMA, имитирующей конститутивное деацетилирование (замена лизина на аргинин в сайте мишени SIRT2), в старых или обработанных ингибитором NAMPT (FK866) МСК восстановит перпендикулярную ориентацию веретена деления и долю асимметричных делений (Pax7+/MyoD- и Pax7+/MyoD+) на изолированных миоволокнах без восстановления митохондриального дыхания или общего уровня NAD+.

Механизм. BMAL1/CLOCK обеспечивают ритмическую транскрипцию Nampt и соответствующие колебания уровня NAD+, которые в норме определяют SIRT1-зависимую готовность клеток к активации. В старых сателлитных клетках регуляторная активность BMAL1 снижается, из-за чего амплитуда колебаний NAD+ уменьшается. Поэтому активация часто начинается в фазе минимума NAD+, когда активности SIRT1 недостаточно для своевременного выхода из состояния покоя G0.

Предсказание. При повреждении мышц старых мышей в предполагаемой фазе максимального уровня NAD+ измерения выявляют различия в показателях регенерации мышечных волокон и числе сателлитных клеток EdU+ по сравнению с повреждением в фазе минимального уровня NAD+; у молодых мышей зависимость от фазы выражена слабее. Введение никотинамидрибозида (NR) в фазе минимального уровня NAD+ эффективнее введения той же суточной дозы в фазе максимального уровня NAD+ или её равномерного распределения в течение суток.

Механизм. С возрастом снижаются экспрессия NMNAT1 и активность этого фермента, что уменьшает доступность ядерного NAD+ для SIRT1/SIRT6 на миогенных энхансерах (Myod1, Myf5, элементы вблизи Pax7). Стойкое гипоацетилирование H3K9ac/H4K16ac и нарушение удаления репрессивных меток задерживают транскрипционную активацию миогенной программы. При этом субстраты митохондриальных сиртуинов остаются относительно защищёнными от этих изменений благодаря активности NMNAT3 и импорту NAD+, которые не зависят от MRP.

Предсказание. Ожидается, что экспрессия направленного в ядро NMNAT1 только в сателлитных клетках старых мышей восстановит своевременность первого деления, индукцию MyoD и площадь поперечного сечения мышечных волокон после повреждения кардиотоксином. Такой же эффект ожидается от действующего только в ядре модуля NMN/NAD, работа которого подтверждена биосенсором NAD+. Экспрессия направленного в митохондрии NMNAT3 только в сателлитных клетках при таком же приросте общего содержания NAD+ не должна давать такого эффекта. Ожидается, что сенсоры NAD+, позволяющие измерять его уровень отдельно в разных компартментах, выявят снижение ядерного NAD+ более чем на 50 % и митохондриального NAD+ менее чем на 20 % в покоящихся сателлитных клетках старых животных.

Механизм. При достаточном NAD+ GAPDH нитрозилируется и с Siah1 транспортируется в ядро, где подавляет c-Myc; при дефиците NAD+ этот шаг пропускается, клетки пролиферируют дольше и накапливают повреждения перед терминальной дифференцировкой.

Предсказание. Ядерно-локализованный фосфомиметический GAPDH у старых MuSC сократит избыточные раунды деления и повысит долю слившихся миотрубок после повреждения независимо от уровня цитозольного NAD+.

Механизм. Недостаток NAD+ ограничивает окисление альдегидов митохондриальной альдегиддегидрогеназой ALDH2. Предполагается, что накопившиеся альдегиды образуют аддукты с белками ядерной ламины, повышая жёсткость ядра и вероятность его повреждения при миграции.

Предсказание. При сопоставимой жизнеспособности старые клетки с низким митохондриальным NAD+ хуже проходят через узкие каналы, чем через широкие. Связывание реакционноспособных альдегидов уменьшает модификации белков ламины, восстанавливает прохождение через узкие каналы и распределение клеток в очаге повреждения при сохраняющемся дефиците NAD+.

Механизм. Предполагается существование функционально значимой популяции транскриптов Myod1 с NAD+ на 5′-конце. Снижение доступности NAD+ при инициации транскрипции меняет соотношение вариантов кэпирования и ускоряет накопление белка MYOD1 до завершения необходимого числа делений.

Предсказание. В старых клетках обнаруживается снижение NAD-кэпирования Myod1, предшествующее ускоренному накоплению MYOD1. Избирательное восстановление этого кэпирования при сопоставимом количестве транскриптов увеличивает число делений перед дифференцировкой и вклад клеток в регенерирующие волокна.

Механизм. ARTD10 использует NAD+ для mono-ADPr STAT3; при нехватке NAD+ фосфо-STAT3 не удерживается в ядре достаточно долго для индукции циклинов, нужных для первого раунда пролиферации.

Предсказание. Экспрессия каталитически активного ARTD10 в старых MuSC восстановит ранний пик пролиферации после повреждения при условии достаточного локального NAD+, тогда как мутант ARTD10 без ADP-рибозилтрансферазной активности эффекта не даст.

Механизм. При переходе МСК к гликолитической пролиферации падение пула свободного цитозольного NAD+ смещает равновесие глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (GPD1) в сторону накопления глицерол-3-фосфата за счет истощения пула DHAP, поступающего в пероксисомы для синтеза предшественников плазмалогенов. Нехватка винил-эфирных связей плазмалогенов лишает мембрану эндогенной антиоксидантной защиты от перекисного окисления липидов и нарушает формирование полуслияния (hemifusion) липидного бислоя при образовании миотуб.

Предсказание. Экспрессия цитозольной NADH-оксидазы LbNOX (повышающей отношение NAD+/NADH без увеличения общего пула NAD+ и без активации сиртуинов) или добавление алкилглицерола (обходящего DHAP-зависимый пероксисомальный этап) восстановит уровень плазмалогенов, предотвратит ферроптоз и вернет способность к слиянию старым МСК после травмы хлоридом бария.

Механизм. Предполагается, что в восприимчивых клетках повышение отношения никотинамидмононуклеотида к NAD+ активирует NAD+-гидролазу SARM1. Последующее расщепление NAD+ усиливает исходный дефицит и формирует пороговый переход к гибели клетки.

Предсказание. Наблюдение за отдельными клетками выявляет резкие эпизоды падения NAD+, предшествующие гибели, преимущественно у старых животных. Удаление Sarm1 только в мышечных стволовых клетках устраняет эти эпизоды и увеличивает число регенеративных клонов, хотя исходный возрастной дефицит NAD+ сохраняется.

Механизм. Низкий NAD+ смещает равновесие в сторону хронической активации PARP1 на базальном уровне повреждения ДНК; PARилированный Pax7 хуже связывается с промоторами генов асимметричного деления.

Предсказание. Ингибирование PARP1 у старых MuSC восстановит долю асимметричных делений и регенерацию мышцы без существенного повышения общего NAD+, тогда как у молодых животных тот же ингибитор ухудшит репарацию ДНК.

Механизм. Длительное пребывание в состоянии покоя способствует накоплению одноцепочечных разрывов ДНК (SSB). Для распознавания повреждений белком PARP1 и привлечения XRCC1 необходим NAD+, который используется для синтеза поли(АДФ-рибозы). В старых клетках с низким уровнем NAD+ при вступлении в S-фазу нерепарированные SSB приводят к образованию двуцепочечных разрывов и остановке репликационных вилок. Это активирует сигнальный путь ATR-CHK1 и вызывает p21-зависимую остановку клеточного цикла или апоптоз.

Предсказание. В покоящихся сателлитных клетках старых животных щелочной вариант метода ДНК-комет выявляет повышенное количество одноцепочечных разрывов ДНК (SSB), а фокусы γH2AX/53BP1 появляются именно в первой EdU+ S-фазе. Совместное восполнение NAD+ и восстановление PARP1 или XRCC1 снижает уровень γH2AX в первой S-фазе и улучшает регенерацию сильнее, чем каждое из этих воздействий по отдельности; делеция p21 восстанавливает выживаемость клеток, однако их потомки имеют геномные нарушения.

Механизм. Недостаток NAD+ ограничивает образование окисленного NADP+ NAD-киназой и последующее пополнение локального NADPH. Предполагается, что это ослабляет краткие импульсы образования активных форм кислорода NADPH-оксидазой NOX2, необходимые для перестройки актинового цитоскелета в месте слияния.

Предсказание. У дифференцированных потомков старых клеток снижаются локальные импульсы окисления у мембраны при сохранённой экспрессии белков слияния. Восстановление локального образования NADPH повышает частоту слияния при низком общем NAD+, а подавление NOX2 устраняет этот эффект.

Механизм. Быстрое клональное размножение активированных МСК требует резкого усиления транскрипции рДНК РНК-полимеразой I, где SIRT7 деацетилирует фибрилларин и субъединицу PAF53, предотвращая столкновение комплексов транскрипции и репликации. В старых МСК фоновые одноцепочечные разрывы ДНК гиперактивируют PARP1, который исчерпывает ядерный NAD+ (Km у PARP1 ниже, чем у SIRT7), что инактивирует SIRT7, вызывает накопление R-петель в ядрышке, транслокацию рибосомных белков RPL5/RPL11 в нуклеоплазму и стабилизацию p53 через ингибирование MDM2.

Предсказание. Направленная в ядрышко экспрессия РНКазы H1 (разрушающей R-петли) в старых или дефицитных по NMNAT1 МСК предотвратит дезинтеграцию ядрышка, подавит стабилизацию p53 и восстановит клональную экспансию транзиторно-амплифицирующихся миобластов на 3–4 сутки после повреждения без восстановления уровня NAD+.

Механизм. NAD+ модулирует активность SIRT1/CLOCK; при хронически низком NAD+ пик экспрессии Cxcr4 и M-cadherin смещается на 4–6 ч относительно волны CCL2/TNF, ослабляя хемотаксис.

Предсказание. Временная синхронизация введения NMN с субъективной ночью старых животных восстановит совпадение фазы активации MuSC с воспалительным пиком и улучшит закрытие дефекта мышцы сильнее, чем та же доза NMN днём.

Механизм. Недостаточная активность NAD+-зависимой деацетилазы SIRT2 поддерживает повышенное ацетилирование тубулина реснички. Предполагается, что это препятствует своевременной разборке аксонемы и освобождению базального тельца для последующих событий клеточного цикла.

Предсказание. Кратковременное направление активной деацетилазы HDAC6 к ресничке сразу после повреждения нормализует время её разборки, ускоряет первое деление и увеличивает регенеративный вклад старых клеток при сохраняющемся низком NAD+. Каталитически неактивная HDAC6 и воздействие после первого деления дают меньший эффект.

Механизм. CD38 потребляет NAD+ для синтеза cADPR; при низком субстрате амплитуда Ca2+-спайков через ryanodine-рецепторы падает, задерживая кальций-зависимую активацию кальциневрина–NFAT и старт Myf5.

Предсказание. Прямая доставка мембранопроницаемого cADPR в старые MuSC восстановит ранние Ca2+-осцилляции и выход из покоя без повышения внутриклеточного NAD+, тогда как у молодых клеток избыток cADPR вызовет преждевременную активацию.

Механизм. Синтез NAD+ из предшественников в сателлитных клетках зависит от NRK1 (NR→NMN) и транспорта NMN внутрь клетки; возрастное снижение этих функций нарушает связь между уровнем циркулирующих предшественников и внутриклеточным уровнем NAD+. В этих условиях наблюдаемые благоприятные эффекты введения предшественников обусловлены действием фибробластов, эндотелиальных клеток и макрофагов, которые сохраняют способность поглощать предшественники и изменяют клеточную нишу.

Предсказание. В выделенных сортировкой старых сателлитных клетках мышей, получавших NR, уровень NAD+ не повышается, несмотря на его повышение в мышечной ткани. Делеция Nmrk1 только в клетках, экспрессирующих Pax7, не устраняет благоприятное действие NR на регенерацию у старых мышей, тогда как сверхэкспрессия NRK1 только в сателлитных клетках в сочетании с введением NR дополнительно увеличивает их численность за счёт клеточно-автономного действия.

Механизм. Mono- или poly-ADPr актин-связывающих белков модулирует скорость сборки ламеллоподий; при низком NAD+ MuSC медленнее хемотаксируют по градиенту HGF/SDF-1 и хуже занимают нишу на повреждённом волокне.

Предсказание. Визуализация прижизненной миграции покажет, что повышение локального NAD+ в старых MuSC ускорит их перемещение к краю раны и увеличит число клеток, встроившихся в волокно в первые 72 ч, без изменения их пролиферативного индекса.

Механизм. Транскрипционный корепрессор CtBP1/2 обладает на два порядка более высоким сродством к NADH, чем к NAD+, и при повышенном уровне ядерного NADH формирует стабильные димеры, рекрутирующие гистондеметилазу LSD1 и HDAC1/2 к транскрипционному фактору RBPJ. В старых миогенных прогениторах низкое отношение NAD+/NADH не позволяет приходящему сигналу Notch (NICD) диссоциировать димер CtBP с промоторов генов Hes1, Hey1 и Col5a1, лишая клетки способности остановить миогенную программу и заново заселить сателлитную нишу.

Предсказание. Введение точечной мутации в NADH-связывающий домен CtBP1/2 (G183A), нарушающей его NADH-зависимую димеризацию, или экспрессия ядерно-локализованной NADH-оксидазы (NLS-LbNOX) в старых МСК восстановит индуцируемую лигандом Dll1 экспрессию Hey1/Col5a1 и численность покоящихся Pax7+ клеток на 14-е сутки после травмы независимо от активности сиртуинов.

Механизм. Ацетилированный комплекс I генерирует избыток супероксида; окисленный Notch-ICD хуже трансактивирует Hes/Hey, необходимые для сохранения одной дочерней клетки в стволовом состоянии.

Предсказание. Митохондриально-таргетированный антиоксидант плюс активатор SIRT3 у старых MuSC вернут долю асимметричных делений Notch-зависимо, тогда как один лишь цитозольный антиоксидант этого не сделает.

Механизм. Для терминальной дифференцировки и слияния миобластов необходим пионерский ремоделинг хроматина на локусах Mymk и Mymx, опосредованный взаимодействием MyoD с субъединицей BAF60c. При старении дефицит NAD+ лишает ядерный фермент SIRT6 косубстрата для моно-АДФ-рибозилирования BAF60c, что блокирует сборку функционального мышечно-специфического комплекса BAF на промоторах генов слияния даже при нормальной деацетилазной активности гистонов.

Предсказание. Экспрессия мутанта SIRT6-G60A (сохраняющего деацетилазную активность, но лишенного моно-АДФ-рибозилтрансферазной активности) не сможет восстановить открытость хроматина (ATAC-seq) в локусе Myomaker и слияние миобластов в старых МСК с восполненным пулом NAD+, тогда как искусственная сшивка BAF60c с MyoD устранит дефект слияния на фоне дефицита NAD+.

Механизм. РНК-полимераза II использует свободный ядерный NAD+ в качестве неканонического инициаторного нуклеотида для формирования 5'-NAD-кэпа на базально экспрессируемых транскриптах (включая Myod1 и гены мишеней Wnt/TGF-β), что служит меткой для их быстрой деградации нуклеазой DXO (decapping exoribonuclease). Возрастное падение активности ядерного фермента NMNAT1 снижает отношение NAD+/ATP в ядре, переключая инициацию транскрипции на канонический m7G-кэп, что приводит к накоплению этих мРНК и нарушению координации раннего ответа на повреждение.

Предсказание. Профилирование NAD-кэпированных РНК (ONE-seq/NAD-cap-seq) покажет избирательную потерю 5'-NAD-кэпов на мРНК Myod1 и профибротических генов в старых покоящихся МСК по сравнению с молодыми, а условный нокаут гена Dxo в молодых МСК воспроизведет фенотип преждевременной стабилизации этих транскриптов и дефектной регенерации при неизменном уровне внутриклеточного NAD+.

Механизм. Внеклеточный АТФ, высвобождаемый из разрушенных миоволокон, стимулирует выброс Ca2+ через IP3R в зонах MAM для метаболического запуска цикла Кребса в активирующихся МСК. При дефиците митохондриального NAD+ и падении активности SIRT3 гиперацетилированные MFN2 и VDAC1 формируют избыточно плотные и стабильные контакты ЭР-митохондрии, превращая физиологический кальциевый импульс в кальциевую перегрузку, открытие поры mPTP, выход фрагментов мтДНК через олигомеры VDAC1 и активацию провоспалительного каскада cGAS-STING.

Предсказание. Фармакологическое ингибирование олигомеризации VDAC1 (VBIT-4) или экспрессия пептида-антагониста сближения ЭР и митохондрий в первые 24 часа после травмы предотвратит выход мтДНК в цитозоль, подавит фосфорилирование TBK1/IRF3 и восстановит регенеративный потенциал старых NAD+-дефицитных МСК.

Механизм. PHGDH использует NAD+ как кофактор. Повышенное отношение NADH/NAD+ в старых клетках подавляет синтез серина из предшественников, снижает поступление глицина и формиата в фолатзависимый одноуглеродный обмен и уменьшает содержание SAM. Снижение содержания SAM нарушает триметилирование H3K4 (H3K4me3) комплексом MLL в области генов Myod1/Myog, задерживая запуск транскрипционной программы активации клеток.

Предсказание. Экспрессия цитозольной NADH-оксидазы LbNOX, образующей воду, в сателлитных клетках старых мышей восстанавливает включение метки из глюкозы в серин и формиат, повышает содержание SAM и уровень H3K4me3 в локусах генов миогенеза и улучшает регенерацию без увеличения общего содержания NAD+. Добавление серина/формиата в рацион частично воспроизводит этот восстановительный эффект; направленная в митохондрии mitoLbNOX такого эффекта не даёт.

Механизм. PARP10/PARP14 используют NAD+ для моно-АДФ-рибозилирования (MAR) рибосомных белков, эукариотических факторов инициации трансляции (eIF) и РНК-хеликаз. Эта модификация регулирует темп нарастания трансляции, согласуя его с биогенезом рибосом, возможностями шаперонов и поступлением питательных веществ. При низком уровне NAD+ моно-АДФ-рибозилирование ослабевает, и интенсивность трансляции превышает возможности шаперонов. Это активирует интегрированный стрессовый ответ (ATF4/CHOP) и останавливает клеточный цикл.

Предсказание. Протеомный анализ, направленный на выявление моно-АДФ-рибозилирования (MAR), выявляет при активации старых сателлитных клеток снижение этой модификации у рибосомных белков и факторов инициации трансляции; восполнение NAD+ восстанавливает её уровень. Фармакологическое или генетическое подавление инициации трансляции на раннем этапе активации (независимое от ISRIB подавление активности eIF4E низкой дозой препарата либо импульсное введение рапамицина только в первые 24 ч) улучшает регенерацию в старом возрасте, а сверхэкспрессия PARP10 восстанавливает её при неизменном уровне NAD+.

Механизм. Белок SARM1 в норме заблокирован связыванием NAD+ с его регуляторным ARM-доменом, но активируется при падении концентрации NAD+ и конкурентном связывании NMN. В старых МСК, где экспрессия NMNAT снижена сильнее, чем NAMPT, повреждение ткани провоцирует активацию TIR-домена SARM1, генерацию вторичного мессенджера cADPR, открытие каналов RYR1 в эндоплазматическом ретикулуме и активацию кальпаина-1, который избирательно расщепляет Pax7 и блокирует возврат прогениторов в нишу.

Предсказание. Генетическая делеция Sarm1 или фармакологическая блокада cADPR (8-Br-cADPR) в старых МСК предотвратит деградацию белка Pax7 и восстановит пул самообновляющихся сателлитных клеток после инъекции кардиотоксина, тогда как введение высоких доз NMN на фоне сниженной активности NMNAT1 парадоксально усилит потерю Pax7 в старых МСК дикого типа, но не в МСК с нокаутом Sarm1.

Механизм. Гиперацетилированный тубулин стабилизирует астральные микротрубочки неправильной полярности; плоскость деления уходит от оси «базальная–апикальная», обе дочерние клетки получают дифференцировочные сигналы.

Предсказание. Ингибирование HDAC6 (компенсаторно снижающее ацетил-тубулин) у старых MuSC восстановит правильную ориентацию веретена и долю асимметричных делений только при одновременном умеренном повышении NAD+, подтверждающем зависимость от SIRT2.

Механизм. Снижение скорости реакций, катализируемых NMNAT1/2, в старых клетках приводит к накоплению NMN. Связывание NMN с доменом ARM белка SARM1 снимает аутоингибирование, после чего активированный SARM1 катализирует расщепление NAD+. Возникающее самоусиливающееся истощение NAD+ нарастает именно в период, когда активация клетки повышает потребность в NAD+, и приводит к острому дефициту аденозинтрифосфата (ATP), нарушению выхода из G0 и апоптозу активирующихся клеток.

Предсказание. Ожидается, что делеция Sarm1 только в клетках Pax7+ у старых мышей улучшит регенерацию и увеличит численность сателлитных клеток после повреждения, а также ослабит резкое снижение уровня NAD+ после повреждения, измеряемое в отсортированных клетках. Введение только NMN должно ухудшать регенерацию у старых мышей с сохранным Sarm1 либо оставлять её нарушенной, тогда как у старых мышей с нокаутом Sarm1 ожидается восстановление регенерации.

Механизм. Недостаток NAD+ снижает каталитическую активность ядерного SIRT1; накопление ацетил-H4K16 удерживает хроматин MyoD в полузакрытом состоянии и задерживает транскрипционный старт активации.

Предсказание. Восстановление ядерного NAD+ (например, через ядерно-таргетированный NMN) нормализует уровень H4K16ac на энхансерах MyoD и ускоряет выход MuSC из покоя у старых мышей сильнее, чем системное повышение цитозольного NAD+ при равном общем уровне NAD+.

Механизм. Низкая активность NMNAT1 оставляет высокий никотинамид в ядре; никотинамид конкурентно тормозит SIRT6, ослабляя резекцию концов ДНК и замедляя пролиферацию после травмы.

Предсказание. Ядерная сверхэкспрессия NMNAT1 у старых MuSC снизит ядерный никотинамид, повысит активность SIRT6 и ускорит разрешение γH2AX-фокусов в S-фазе сильнее, чем эквивалентное повышение цитозольного NMNAT2.