Гипотезы по вопросу

Механизм. Недостаточная активность NAD+-зависимого фермента SIRT1 изменяет деацетилирование белков циркадных часов, сдвигая фазу готовности клеток к активации относительно времени поступления воспалительных сигналов и сигналов факторов роста. В результате клетки пропускают благоприятный для активации период, даже если их среднесуточное обеспечение энергией остаётся достаточным.

Предсказание. При одинаковой суммарной экспозиции влияние кратковременного введения предшественника NAD+ на регенерацию должно зависеть от циркадной фазы. Введение в предполагаемый период готовности клеток к активации должно быть эффективнее непрерывного введения. После нарушения работы основного механизма циркадных часов исключительно в мышечных стволовых клетках преимущество введения в этот период перед непрерывным введением должно исчезнуть.

Механизм. Недостаток доступного NAD+ ограничивает NAD+-зависимую реакцию, катализируемую фосфоглицератдегидрогеназой. Снижение синтеза серина ограничивает перенос одноуглеродных групп при синтезе пуринов и тимидилата, вызывая репликационный стресс ещё до того, как станет заметным существенное снижение уровня аденозинтрифосфата (ATP) в клетках.

Предсказание. Изотопное мечение должно выявить снижение синтеза серина и нуклеотидов из глюкозы в активированных клетках с дефицитом NAD+. Добавление нуклеозидов должно восстанавливать репликацию и вклад клеток в регенерацию при сохраняющемся низком уровне NAD+, тогда как вмешательство, восстанавливающее уровень ATP без восстановления обеспеченности нуклеотидами, не должно давать такого эффекта.

Механизм. Во время активации клеток PARP1-зависимая репарация повышает потребность в ядерном NAD+. В старых клетках с ограниченной доступностью NAD+ этот временный рост потребности препятствует SIRT6-зависимому деацетилированию H3K9 на энхансерах воспалительных генов. В результате транскрипция воспалительных генов продолжается после устранения повреждений ДНК.

Предсказание. Восстановление уровня никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) в ядре именно в начальный период репарации должно нормализовать ацетилирование энхансеров и повысить вклад клеток в регенерацию, оцениваемый по результатам отслеживания их потомков. Этот эффект должен исчезнуть при утрате каталитической активности SIRT6, несмотря на сопоставимую репарацию ДНК, а более позднее восстановление уровня NAD+ должно быть менее эффективным.

Механизм. Переход от покоя к быстрой пролиферации требует резкого усиления транскрипции повторяющихся участков рибосомной ДНК (rDNA) 47S с участием РНК-полимеразы I. Это создаёт топологическое напряжение и приводит к образованию гибридов РНК и ДНК (R-петель) во время транскрипции. В молодых мышечных стволовых клетках (MuSCs) никотинамидадениндинуклеотид в окисленной форме (NAD+), синтезируемый в ядрышке ферментом NMNAT1, обеспечивает работу SIRT7, который деацетилирует и активирует DDX21. Активированный DDX21 расплетает R-петли в rDNA. В старых MuSCs дефицит ядрышкового NAD+ сохраняет DDX21 в гиперацетилированном и неактивном состоянии. Это вызывает обширное накопление R-петель в rDNA, фрагментацию ядрышка и высвобождение свободного RPL11, который подавляет MDM2 и вызывает остановку клеточного цикла, опосредованную p53.

Предсказание. Иммунопреципитация гибридов ДНК и РНК с последующей количественной полимеразной цепной реакцией (DRIP-qPCR) и иммунофлуоресцентный анализ старых MuSCs через 48 часов после повреждения выявят выраженное накопление R-петель именно в локусах rDNA 47S, гиперацетилированный DDX21 и образование комплекса RPL11-MDM2. Направленная доставка RNase H1 в ядрышко или экспрессия в старых MuSCs мутантного DDX21, имитирующего деацетилированное состояние, предотвратит активацию p53 и восстановит пролиферацию миобластов.

Механизм. NAMPT использует фосфорибозилпирофосфат (PRPP) для превращения никотинамида в никотинамидмононуклеотид (NMN). Когда клетки быстро проходят клеточные циклы, расход PRPP на эту реакцию снижает уровни инозинмонофосфата (IMP), аденозинтрифосфата (ATP) и гуанозинтрифосфата (GTP) ниже значений, необходимых для репликации ДНК, даже при частичном восстановлении уровня NAD+.

Предсказание. Умеренное ингибирование никотинамидфосфорибозилтрансферазы (NAMPT) или добавление фосфорибозилпирофосфата (PRPP) увеличивает число миобластов, включивших 5-этинил-2′-дезоксиуридин (EdU), и размер регенерированных волокон в стареющей мышце, одновременно ещё сильнее снижая уровень окисленной формы никотинамидадениндинуклеотида (NAD+). Добавление пуриновых нуклеозидов восстанавливает клональную экспансию без повышения уровня NAD+.

Механизм. Предполагается, что в ответ на низкий уровень NAD+ ускоряется обмен никотинамида и усиливается его NNMT-зависимое метилирование. При этом расходуется S-аденозилметионин и снижается способность к метилированию, что препятствует восстановлению репрессивного состояния хроматина в области генов дифференцировки, когда выжившие клетки пытаются вернуться в состояние покоя.

Предсказание. В клетках, происхождение которых прослежено, должно увеличиться количество никотинамида, проходящего метилирование за единицу времени, и снизиться соотношение S-аденозилметионина и S-аденозилгомоцистеина, а хроматин в области генов дифференцировки должен оставаться доступным длительное время. Временное ингибирование никотинамид-N-метилтрансферазы (NNMT) при возвращении клеток в состояние покоя должно улучшать регенерацию после повторного повреждения даже при экспериментальном поддержании NAD+ на том же низком уровне; отсутствие экспрессии NNMT или отсутствие метаболического потока через реакцию метилирования никотинамида опровергнет этот механизм.

Механизм. Воспалительные сигналы, связанные с повреждением, повышают экспрессию NNMT в старых SCs. Этот фермент расходует и никотинамид (NAM), снижая интенсивность синтеза NAD+ по пути реутилизации, и S-аденозилметионин (SAM), уменьшая доступность донора метильных групп для метилтрансфераз H3K4/H3K27 и миогенных сигнальных процессов, зависящих от протеин-аргининметилтрансфераз (PRMT). Одновременное истощение этих двух субстратов связывает потерю NAD+ с нарушениями метилирования, которые введение предшественников устранить не может.

Предсказание. В старых сателлитных клетках (SCs) повышены уровни матричной РНК (mRNA) Nnmt и 1-метилникотинамида (MNAM). Специфичный для SCs нокаут Nnmt или селективный ингибитор никотинамид-N-метилтрансферазы (NNMT) восстанавливает в SCs уровень NAD+, отношение S-аденозилметионина к S-аденозилгомоцистеину (SAM/SAH) и индукцию MyoD, а также регенерацию мышечных волокон у старых мышей, превосходя по эффективности введение эквимолярной дозы никотинамидрибозида (NR). Принудительная сверхэкспрессия NNMT в молодых SCs ухудшает регенерацию даже при одновременном введении NR.

Механизм. При терминальной миогенной дифференцировке локализованной в аппарате Гольджи моно-АДФ-рибозилтрансферазе PARP12 требуется относительно высокая концентрация NAD+ в цитозоле из-за высокой константы Михаэлиса (Km) для NAD+. При этой концентрации PARP12 моно-АДФ-рибозилирует белок Golgin-97, обеспечивающий прикрепление везикул и сортировку Myomaker (TMEM8C) в Rab11a+ экзоцитозные переносчики. Возрастное снижение уровня NAD+ избирательно и полностью подавляет каталитическую активность PARP12, при этом активность ферментов с более низкой Km сохраняется. В результате Myomaker задерживается в транс-сети аппарата Гольджи, а регенерация останавливается на стадии одноядерных миоцитов.

Предсказание. У дифференцирующихся миобластов старого организма уровни матричной РНК (mRNA) Myomaker и общее содержание этого белка будут нормальными. При этом Myomaker будет задерживаться в околоядерном аппарате Гольджи, а моно-АДФ-рибозилирование Golgin-97 будет утрачено. Экспрессия искусственно созданного варианта PARP12 с низкой константой Михаэлиса (Km) в мышечных стволовых клетках (MuSCs) старого организма восстановит локализацию Myomaker на поверхности клеток и слияние миотрубок in vivo.

Механизм. Снижение уровня ядерного NMNAT1 относительно митохондриального NMNAT3 смещает синтез NAD+ за пределы ядра. В результате ядерные ACSS2 и лактатдегидрогеназа (LDH) теряют способность поддерживать содержание NAD+ или ацетил-КоА вблизи хроматина, поэтому ацетилирование лизина 27 гистона H3 (H3K27ac) в энхансерах генов дифференцировки нарушается даже при сохранном митохондриальном дыхании.

Предсказание. NMNAT1, направленный в ядро, восстанавливает H3K27ac в энхансерах Myog и генов миозина, а также образование новых мышечных волокон, при этом содержание митохондриального NAD+ и потребление кислорода остаются низкими. NMNAT3, направленный в митохондрии, нормализует дыхание, но не восстанавливает ацетилирование энхансеров и регенерацию.

Механизм. В покоящихся MuSCs молодых организмов сигналы повреждения вызывают кратковременное локальное повышение активности SIRT2 в базальном тельце реснички. Для деацетилирования альфа-тубулина (alpha-tubulin) и деполимеризующего кинезина KIF2A ферменту необходим цитозольный NAD+. Это обеспечивает быструю разборку аксонемы перед митозом. В MuSCs старых организмов из-за снижения уровня цитозольного NAD+ белок KIF2A остаётся гиперацетилированным и каталитически неактивным. В результате первичные реснички сохраняются при переходе G1/S, нарушается распределение материнских и дочерних центриолей и утрачивается асимметричное распределение Par3/p38-alpha/beta.

Предсказание. Визуализация живых повреждённых мышечных волокон старых мышей выявит сохраняющиеся Arl13b+ реснички и гиперацетилированный KIF2A в делящихся Pax7+ клетках. Экспрессия мутантного KIF2A, имитирующего деацетилированную форму, в мышечных стволовых клетках (MuSCs) старых организмов или в MuSCs с ингибированным NAMPT восстановит резорбцию реснички и образование способных к самообновлению дочерних Pax7+/MyoD- клеток, при этом общий уровень NAD+ останется сниженным.

Механизм. Ядерный NAD+ образует кинетически обособленный пул, который поддерживается NMNAT1. При снижении его уровня PARP1 теряет способность завершать удаление репрессивных комплексов, зависящее от ADP-рибозилирования, а SIRT6 теряет способность деацетилировать H3K9/H3K56 в области миогенных энхансеров. Поэтому хроматин в области этих энхансеров остаётся закрытым даже при частичном восстановлении общего клеточного уровня NAD+.

Предсказание. Ожидается, что биосенсоры NAD+, направленные в определённые клеточные компартменты (ядерные и митохондриальные PercevalHR/NAD-Snifit), выявят избирательное снижение уровня NAD+ в ядрах старых мышечных стволовых клеток (SCs). Сверхэкспрессия NMNAT1, при которой белок локализуется исключительно в ядре, должна восстановить индукцию MyoD и регенерацию у старых мышей. Сверхэкспрессия NMNAT3, при которой белок направляется в митохондрии, должна повысить митохондриальный уровень NAD+ и усилить дыхание, но не восстановить регенерацию.

Механизм. При некрозе мышечных волокон в регенеративную нишу высвобождаются большие количества гема и лабильного железа, создавая условия для интенсивного перекисного окисления липидов. Активированные мышечные стволовые клетки (MuSCs) молодых организмов выживают в этом микроокружении, поскольку цитозольный никотинамидадениндинуклеотид (NAD+) служит субстратом для NAD-киназы (NADK) и непосредственно обеспечивает белок-супрессор ферроптоза FSP1 восстановленными кофакторами NADH/NADPH для восстановления убихинона до убихинола, улавливающего радикалы. Белок FSP1 локализован на плазматической мембране. В MuSCs старых организмов при истощении NAD+ система FSP1-CoQ10H2 на сарколемме утрачивает способность обеспечивать антиоксидантную защиту, что вызывает гибель путём ферроптоза ещё до первого митотического деления.

Предсказание. В MuSCs старых организмов, выделенных через 36 часов после повреждения кардиотоксином, будут выявлены высокий уровень перекисного окисления липидов по сигналу C11-BODIPY, повышенное отношение окисленной формы CoQ10 к восстановленной и ранняя гибель клеток. Эту гибель в живом организме будут избирательно предотвращать liproxstatin-1 или специфичная для MuSCs сверхэкспрессия NADK; ингибиторы каспаз или RIPK1 такого эффекта не дадут.

Механизм. NAD-киназа (NADK) фосфорилирует NAD+ до окисленной формы никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADP+), после чего реакции пентозофосфатного пути обеспечивают регенерацию NADPH для работы глутатионпероксидазы 4 (GPX4). При снижении уровня NADPH перекиси липидов избирательно накапливаются в дочерних клетках, вступивших в клеточный цикл.

Предсказание. В дочерних клетках стареющих мышечных стволовых клеток перекисное окисление липидов предшествует индукции p16 и активации каспаз. Сверхэкспрессия GPX4 или применение липофильного антиоксиданта, улавливающего радикалы, восстанавливает число регенерированных волокон при сохраняющихся низком уровне NAD+ и низкой интенсивности митохондриального дыхания. Сенолитики, делеция p16 и антиоксиданты, направленно действующие в митохондриях, такого эффекта не дают.

Механизм. Сиртуин 1 (SIRT1) должен деацетилировать ACSS2, чтобы этот фермент мог синтезировать ацетилкофермент A (acetyl-CoA) из ацетата в ядре. Если ACSS2 остаётся ацетилированной, в локусах, реагирующих на повреждение, отсутствует ацетилирование лизина 27 гистона H3 (H3K27ac), несмотря на обилие ацетата.

Предсказание. Устойчивый к ацетилированию, конститутивно активный мутант ACSS2 восстанавливает связанное с миогенезом ацетилирование гистонов в стареющих мышечных стволовых клетках с низким уровнем NAD+ и восстанавливает регенерацию, не повышая уровень NAD+. Добавление ацетата восстанавливает эти процессы в молодых клетках, но не в стареющих. Сверхэкспрессия ACSS2 дикого типа также не восстанавливает их в стареющих клетках.

Механизм. NNMT метилирует никотинамид до N1-метилникотинамида, конкурируя с NAMPT, и расходует S-аденозилметионин (SAM), необходимый для работы SETD2. Возникающая вследствие этого утрата H3K36me3 усиливает транскрипцию с криптических участков инициации внутри генов дифференцировки.

Предсказание. Удаление NNMT в мышечных стволовых клетках восстанавливает H3K36me3 и регенерацию даже при неполном восстановлении NAD+. Пока уровень NNMT остаётся высоким, никотинамидрибозид восстанавливает NAD+, но не SAM, H3K36me3 или регенерацию, тогда как дополнительное введение SAM восстанавливает H3K36me3 и регенерацию лишь в сочетании с умеренным восстановлением NAD+.

Механизм. Чтобы выйти из состояния покоя, MuSCs должны быстро усилить деградацию в аутолизосомах, которая обеспечивает перестройку органелл и образование субстратов энергетического обмена. В MuSCs молодых организмов цитозольный NAD+ поддерживает опосредованное SIRT2 деацетилирование ATP6V1E1 по остатку Lys99. Это способствует обратимому присоединению цитозольного сектора V1 к мембранному сектору V0 и закислению лизосом. В MuSCs старых организмов гиперацетилированная субъединица ATP6V1E1 не включается в функциональные комплексы V-ATPase. В результате аутолизосомы набухают, их содержимое защелачивается, а катепсин B выходит в цитозоль и расщепляет Pax7.

Предсказание. Анализ методом проксимального лигирования и ратиометрическая визуализация pH в MuSCs старых организмов через 12 часов после повреждения выявят разобщение секторов V1-V0, повышенный pH лизосом и активность катепсина B в цитоплазме. Экспрессия в этих клетках мутантного белка ATP6V1E1-K99R, имитирующего деацетилированное состояние, восстановит закисление лизосом и сохранит уровень белка Pax7 независимо от восполнения NAD+.

Механизм. При низком уровне NAD+ молекулы NMN аллостерически активируют SARM1. Старение уменьшает запас NAD+, поэтому вызванный повреждением кратковременный подъём уровня NMN, который молодые клетки переносят, в стареющих клетках превышает порог активации SARM1 и запускает самоусиливающееся истощение NAD+.

Предсказание. Делеция SARM1 в мышечных стволовых клетках сохраняет NAD+ в течение первых 48 часов после повреждения и восстанавливает регенерацию у старых мышей, слабо влияя на регенерацию у молодых. Мутант SARM1 с нарушенной способностью связывать никотинамидмононуклеотид (NMN) воспроизводит эффект делеции, а снижение уровня NAD+ в молодых клетках прерывает деление только при сохранении у SARM1 способности связывать NMN.

Механизм. В молодых MuSCs высокая концентрация ядерного NAD+ обеспечивает его использование РНК-полимеразой II в качестве неканонического инициирующего нуклеотида в миогенных локусах, подготовленных к активации, таких как Myod1 и Ccnd1. Образующиеся при фоновой транскрипции РНК получают 5'-NAD+-кэп, который направляет их на немедленную деградацию в ядре экзонуклеазой DXO, удаляющей NAD+-кэп. Возрастное истощение ядерного NAD+ приводит к тому, что инициация транскрипции сопровождается исключительно каноническим кэпированием с образованием m7G-кэпа. Это стабилизирует фоновые транскрипты Myod1 и вызывает преждевременный выход клеток из ниши ещё до повреждения.

Предсказание. Секвенирование РНК с NAD+-кэпом методом ONE-seq в свежевыделенных покоящихся MuSCs покажет высокое отношение количества 5'-NAD+-кэпов к количеству m7G-кэпов на транскриптах Myod1 у молодых мышей; у старых мышей значение этого отношения будет ниже. Условная делеция Dxo в Pax7+ MuSCs молодых мышей воспроизведёт характерные для старения утрату состояния покоя и нарушение регенерации.

Механизм. Снижение NAD+-зависимой активности SIRT2 изменяет ацетилирование микротрубочек и пути перемещения рециклирующих эндосом. В результате уменьшается поляризованная доставка интегрина alpha7-beta1 на поверхность клетки, что нарушает направленное перемещение вдоль базальной пластинки и последующее возвращение клеток в нишу.

Предсказание. Восстановление поляризованного рециклинга интегрина должно улучшить возвращение клеток в нишу и ответ на повторное повреждение даже при сохранении низкого уровня NAD+. Восстановительный эффект должен быть теснее связан с транспортом интегрина и направленностью миграции, чем с пролиферацией или митохондриальным дыханием, и исчезать при блокировании связывания alpha7-beta1 с лигандом.

Механизм. Если снижение уровня NAD+ сопровождается уменьшением цитозольного отношения NAD+/NADH, усиленное NADH-зависимое привлечение транскрипционного корепрессора CtBP продлевает подавление экспрессии DLL1. Это меняет то, когда лиганд представляется соседним клеткам-предшественникам, и нарушает баланс между дифференцировкой и пополнением пула стволовых клеток.

Предсказание. Восстановление цитозольного отношения NAD+/NADH должно восстановить динамику DLL1 и согласованность того, как клетки определяют свою дальнейшую судьбу. После нарушения привлечения CtBP к регуляторной области DLL1 дополнительный эффект восстановления этого отношения должен быть небольшим. Восстановительный эффект должен зависеть от контакта между клетками и быть слабее при непрерывной стимуляции Notch, чем при стимуляции с физиологической временной динамикой.

Механизм. Недостаток NAD+ ограничивает SIRT7-зависимое подавление транскрипции рибосомной ДНК при возобновлении клеточного цикла. Избыточная транскрипция реплицирующейся рибосомной ДНК вызывает конфликты между транскрипцией и репликацией. Возникающие повреждения ядрышка сокращают число жизнеспособных клеток-предшественников, участвующих в регенерации.

Предсказание. Кратковременное частичное снижение активности РНК-полимеразы I в течение первой S-фазы должно уменьшить повреждение рибосомной ДНК и восстановить клональное размножение клеток без восстановления уровня NAD+. Такое же вмешательство после первого деления должно давать существенно меньший эффект, что позволит отличить этот механизм от постоянного дефицита энергии.

Механизм. Снижение уровня NAD+ нарушает баланс между транскрипцией и репликацией в митохондриях и вызывает открытие пор повышенной проницаемости митохондрий (mPTP) и потенциалзависимых анионных каналов (VDAC), через которые митохондриальная ДНК (mtDNA) выходит в цитозоль. Активация сигнального пути cGAS-STING в SCs вызывает формирование секретома с преобладанием IL-6/TGF-β. Этот секретом направляет дифференцировку FAPs по фиброгенному пути, вследствие чего внутриклеточный метаболический дефицит приводит к фиброзу ниши.

Предсказание. В старых сателлитных клетках (SCs) повышены содержание митохондриальной ДНК (mtDNA) в цитозоле и уровень фосфорилирования STING; предшественники окисленного никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) устраняют эти изменения. Совместная трансплантация молодых SCs с дефицитом NAD+ (с делецией Nampt) и молодых SCs дикого типа снижает вклад клеток дикого типа в регенерацию. Это передаваемое нарушение устраняется при специфической для SCs делеции Sting1 либо при стабилизации TFAM или блокировании выхода mtDNA без восстановления уровня NAD+.

Механизм. Снижение активности митохондриального SIRT5 усиливает сукцинилирование ферментов, регулирующих обмен сукцината. В результате активированные миогенные клетки-предшественники накапливают сукцинат и выделяют его во внеклеточную среду. Затем в фиброадипогенных клетках-предшественниках, чувствительных к внеклеточному сукцинату, он активирует SUCNR1-зависимые сигнальные пути, способствующие фиброзу.

Предсказание. Кондиционированная среда от миогенных клеток-предшественников со сниженным уровнем NAD+ должна усиливать выработку внеклеточного матрикса посредством сукцината. Удаление гена SUCNR1 только в фиброадипогенных клетках-предшественниках должно уменьшить этот фиброз и улучшить восстановление ткани, несмотря на сохраняющийся низкий уровень NAD+ в мышечных стволовых клетках; отсутствие функционального SUCNR1 в фиброадипогенных клетках-предшественниках опровергло бы предполагаемый механизм.

Механизм. Рециклирующие эндосомы расположены поляризованно и переносят NAMPT. Вместе с более старой центросомой они попадают в базальную дочернюю клетку. Возрастные нарушения распределения центросом и эндосом между дочерними клетками уравнивают их способность к биосинтезу NAD+.

Предсказание. Биосенсор NAD+ выявляет различие в уровне NAD+ между сестринскими клетками после митоза молодых мышечных стволовых клеток; у старых клеток это различие отсутствует. Принудительное обеспечение симметричного распределения NAMPT между дочерними клетками при делении молодых клеток воспроизводит возрастное нарушение как образования резервных клеток, так и дифференцировки. Закрепление NAMPT в одной из дочерних клеток восстанавливает образование резервных клеток с высоким уровнем Pax7 (Pax7-high) из старых клеток. При этом размер пула NAD+ до митоза остаётся прежним.

Механизм. Снижение доступности NAD+ в митохондриях ограничивает NADK2-зависимое образование NADP+ в период повышения митохондриальной активности после повреждения. Последующее недостаточное восполнение митохондриального пула NADPH нарушает обезвреживание пероксидов. В результате окисление липидов приводит к гибели клеток-предшественников, которые в остальном сохраняют функциональную полноценность.

Предсказание. В активированных старых клетках снижение синтеза NADP(H) из митохондриального NAD+ должно предшествовать накоплению пероксидов липидов и гибели клеток. Подавление ферроптоза в течение ограниченного периода должно сохранять вклад этих клеток в регенерацию без восстановления уровня NAD+, тогда как восполнение NAD+ при выключении NADK2 не должно нормализовать митохондриальный пул NADP(H).

Механизм. Внеклеточный никотинамидмононуклеотид (NMN) служит основным предшественником, который после повреждения сателлитные клетки (SC) поглощают посредством SLC12A8 или после дефосфорилирования до никотинамидрибозида (NR). CD38 воспалительных миелоидных клеток и эндотелия старого организма расходует этот межклеточный пул, создавая градиент концентрации и локально истощая этот пул в нише под базальной пластинкой даже при избытке предшественников в системном кровотоке.

Предсказание. Делеция Cd38 только в миелоидных или эндотелиальных клетках старых мышей восстанавливает уровень NAD+ в SC и регенерацию волокон после повреждения; делеция Cd38 только в SC такого эффекта не даёт. Микродиализ межклеточной жидкости у мышей с этими нокаутами показывает восстановление уровней NMN/NAD+ после повреждения. Пересадка старых SC в молодую мышцу восстанавливает их функцию лучше, чем пересадка молодых SC в старую мышцу при воздействии NR на эту мышцу.

Механизм. В старых SCs сохраняется NMN, образующийся при участии NAMPT, но снижается способность NMNAT1/2 синтезировать NAD+, поэтому отношение NMN:NAD+ растёт. Связывание NMN с аллостерическим участком SARM1 активирует его TIR-домен, катализирующий гидролиз NAD+. NAD+ гидролизуется быстрее, чем синтезируется заново, поэтому его запас резко истощается именно в период выхода из состояния покоя, когда клеткам требуется много энергии. При этом образуются сигнальные продукты, подобные циклической аденозиндифосфатрибозе (cADPR).

Предсказание. У старых мышей генотип Sarm1-/- или делеция Sarm1, специфичная для SCs, восстанавливает уровень NAD+ в SCs, кинетику первого деления и площадь поперечного сечения (CSA) регенерированных мышечных волокон после повреждения кардиотоксином. Введение NMN старым мышам дикого типа снижает уровень NAD+ в SCs или не повышает его, тогда как никотинамидрибозид (NR), который менее эффективно предотвращает накопление NMN, или сверхэкспрессия NMNAT1 восстанавливают этот уровень. В изолированных старых SCs ингибитор TIR-домена SARM1 должен блокировать потерю NAD+, а ингибирование NAMPT не должно её блокировать.

Механизм. Для слияния клеток необходим кратковременный этап, который зависит от митохондриального окислительного фосфорилирования (OXPHOS) и регулируется SIRT1. На этом этапе контролируются доставка Myomaker/Myomerger на поверхность клетки и экспонирование фосфатидилсерина (PS). При недостатке NAD+ активность SIRT1 ограничена, поэтому степень ацетилирования белков Myomaker/Myomerger остаётся повышенной, а их локализация остаётся нарушенной. Это снижает индекс слияния при неизменной доле клеток MyoG+.

Предсказание. В регенерирующей мышце старого организма число клеток MyoG+ близко к норме, тогда как число мышечных ядер на волокно и индекс слияния снижены. Введение предшественника NAD+ восстанавливает индекс слияния и число мышечных ядер, не изменяя числа клеток, образующихся при пролиферации, а сверхэкспрессия Myomerger восстанавливает слияние старых клеток независимо от уровня NAD+.

Механизм. NAADP открывает каналы TPC2 на мембране лизосом, и кратковременное повышение концентрации кальция вызывает перемещение mTORC1 к поверхности лизосом. При утрате способности CD38 катализировать обмен азотистого основания сигнальные пути факторов роста сохраняют активность, но их сигналы перестают обеспечивать выход клеток из состояния покоя.

Предсказание. Согласно гипотезе, агонист TPC2 или проникающий в клетки NAADP восстановит лизосомальный mTORC1 и включение этинилдезоксиуридина (EdU) после повреждения, при этом уровень никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) останется низким. Мутантный вариант CD38, сохраняющий способность катализировать обмен оснований, но лишённый NADазной активности, восстановит активацию клеток. Мутантный вариант CD38, обладающий только гидролитической активностью, активацию не восстановит.

Механизм. Кэпы из NAD+ защищают отдельные мРНК от декэпирования. Когда концентрация NAD+ опускается ниже пороговой, этот запас мРНК утрачивается на позднем этапе восстановления ткани, уже после начала дифференцировки. В результате формирование нового пула покоящихся клеток нарушается именно на этапе возвращения в состояние покоя.

Предсказание. Количество мРНК Pax7 и Spry1 с кэпом из NAD+ в старых мышечных стволовых клетках снижается только в период возвращения в состояние покоя. Устойчивые к декэпированию варианты этих транскриптов восстанавливают резерв Pax7-положительных клеток без повышения уровня NAD+. Повышение уровня NAD+ только с 5-го по 10-й день после повреждения сохраняет и кэпы, и клеточный резерв. Такое же повышение только в первые два дня этого эффекта не даёт.

Механизм. При повреждении NAD+, поступающий в митохондрии через SLC25A51, активирует SIRT5. Этот фермент десукцинилирует субъединицу E1 комплекса OGDH и ограничивает её активность, поддерживая высокое соотношение альфа-кетоглутарата и сукцината. Такое соотношение необходимо деметилазе KDM6A с доменом Jumonji для удаления репрессивных меток H3K27me3 с промоторов Myog и Mef2c. В MuSCs старого организма дефицит митохондриального NAD+ вызывает гиперсукцинилирование и чрезмерную активацию OGDH, что приводит к превращению альфа-кетоглутарата в сукцинат и эпигенетической блокаде перехода от пролиферации к дифференцировке.

Предсказание. В активированных MuSCs старого организма будут наблюдаться повышенное сукцинилирование остатков лизина в OGDH, сниженное соотношение альфа-кетоглутарата и сукцината и устойчивое накопление меток H3K27me3 в локусе Myog. Обработка проникающим в клетки диметил-альфа-кетоглутаратом или экспрессия устойчивого к сукцинилированию мутантного варианта OGDH восстановит транскрипцию Myog и созревание мышечных волокон, образующихся из MuSCs с истощённым пулом NAD+.

Механизм. В процессе регенерации MuSCs должны протискиваться через узкие межклеточные пространства в плотной фиброзной ткани вдоль сохранившихся оболочек разрушенных мышечных волокон, чтобы вновь заселить участки повреждения. Для этого ядро должно динамически менять форму. В MuSCs молодого организма ядерный NAD+ поддерживает деацетилазную активность SIRT6 в отношении иммуноглобулиноподобного домена белка Lamin A/C, сохраняя вязкоупругие свойства ядерной ламины. В MuSCs старого организма утрата ядерного NAD+ вызывает гиперацетилирование Lamin A/C и повышение жёсткости ламины. В результате при миграции через узкие пространства ядерная оболочка механически разрывается, геномная ДНК становится доступной цитозольной cGAS, а интерфероны типа I вызывают остановку миграции.

Предсказание. Прижизненная визуализация и исследования миграции через сужения в микрофлюидных устройствах покажут, что в мышечных стволовых клетках (MuSCs) старого организма, содержащих репортёр NLS-GFP, во время миграции часто образуются выпячивания ядерной оболочки, GFP выходит в цитоплазму, а вокруг ядра появляются очаги накопления cGAS. Удаление гена cGAS избирательно в MuSCs или экспрессия варианта Lamin A/C, имитирующего деацетилированное состояние, восстановит скорость миграции клеток и регенерацию мышц старого организма.

Механизм. Для выхода из состояния покоя необходимо кратковременное усиление образования cADPR и аденозиндифосфатрибозы (ADPR) под действием экто-NADазы. Эти молекулы действуют на рианодиновые рецепторы (RyR) и катионный канал TRPM2, вызывая характерное кратковременное повышение концентрации Ca2+, которое активирует сигнальный путь p38-MK2 и способствует накоплению MyoD в ядре. Хотя количество белка CD38 с возрастом увеличивается, резкое сокращение локального запаса NAD+ ограничивает образование cADPR. В результате у части SCs амплитуда кратковременного повышения концентрации Ca2+ оказывается ниже порога активации.

Предсказание. Визуализация SCs непосредственно в ткани с помощью генетически кодируемого кальциевого индикатора GCaMP показывает, что в старой мышце кратковременное повышение концентрации Ca2+ после повреждения начинается позже и имеет меньшую амплитуду. Локальное введение NAD+ восстанавливает этот ответ в течение нескольких минут; введение никотинамидмононуклеотида (NMN) такого эффекта не даёт. Ответ также восстанавливается при активации RyR агонистом, действие которого нечувствительно к 8-Br-cADPR. При активации TRPM2 или RyR1 агонистами SCs старых организмов вновь выходят из состояния покоя без повышения уровня NAD+. При этом меняется доля SCs, которые вообще вступают в S-фазу, а скорость прохождения клеточного цикла остаётся прежней.

Механизм. Для деацетилирования α-тубулина по остатку лизина 40 белку SIRT2 необходим NAD+. Гиперацетилированные микротрубочки теряют прикрепление к базальной пластинке, вследствие чего нарушается связь веретена с нишей, в которой высока активность Notch.

Предсказание. В старых мышечных стволовых клетках повышено ацетилирование α-тубулина по K40; эти клетки перестают делиться вдоль апикобазальной оси. Устойчивый к ацетилированию мутант α-тубулина K40R восстанавливает самообновление Pax7-положительных клеток в старой популяции с низким уровнем никотинамидадениндинуклеотида (NAD+), не повышая его уровень. Вариант α-тубулина, имитирующий ацетилирование K40, полностью подавляет самообновление молодых клеток с нормальным уровнем NAD+.

Механизм. Предполагается, что среди транскриптов MYMK существует функциональная группа с NAD-кэпом, количество транскриптов в которой зависит от доступности NAD+ в ядре. Согласно этой гипотезе, утрата кэпа сокращает время жизни транскриптов при дифференцировке, снижает количество белка myomaker и ограничивает слияние клеток независимо от образования клеток-предшественников.

Предсказание. Сначала методы, основанные на разных принципах и чувствительные к типу кэпа, должны подтвердить существование транскриптов MYMK с NAD-кэпом и показать избирательное снижение их количества в старых клетках. Стабильный транскрипт MYMK с обычным кэпом должен восстанавливать слияние клеток без восстановления уровня NAD+ или пролиферации; если предполагаемый кэп обнаружить не удастся, этот механизм будет опровергнут.

Механизм. PHGDH катализирует лимитирующую стадию синтеза серина de novo и имеет высокую константу Михаэлиса (Km) для обязательного кофактора NAD+, что делает фермент особенно чувствительным к возрастному снижению уровня NAD+. В молодых пролиферирующих MuSCs достаточный уровень NAD+ поддерживает интенсивный метаболический поток через реакцию PHGDH. Образующийся серин используется для синтеза экзосом, обогащённых фосфатидилсерином. Эти экзосомы передают сигнал через MerTK на макрофагах с высокой экспрессией Ly6C (Ly6C-high), вызывая их переход в состояние с низкой экспрессией Ly6C (Ly6C-low), способствующее миогенезу. В старых MuSCs остановка реакции PHGDH перенаправляет промежуточные продукты гликолиза на образование метилглиоксаля. Одновременно образуются везикулы с дефицитом фосфатидилсерина, которые не обеспечивают разрешение воспаления в нише.

Предсказание. Прослеживание метаболизма меченой глюкозы (13C6-glucose) в старых активированных мышечных стволовых клетках (MuSCs) покажет блок на стадии реакции фосфоглицератдегидрогеназы (PHGDH) и снижение содержания меченого серина (13C3-serine), а экзосомы из MuSCs будут слабее связывать Annexin-V. Введение серина с пищей или доставка фосфатидилсерина в составе липосом либо специфичная для MuSCs экспрессия варианта PHGDH с низкой константой Михаэлиса (Km) восстановит переход макрофагов из состояния Ly6C-high в состояние Ly6C-low и регенерацию мышц у старых мышей.

Механизм. При снижении уровня NAD+ повторное окисление с участием лактатдегидрогеназы A (LDH-A) ограничивается, что нарушает баланс реакционных потоков и повышает внутриклеточные уровни лактата и лактилкофермента A (lactyl-CoA). В области промоторов, которые в норме регулируются NAD+-зависимым деацетилированием с участием сиртуинов, накапливаются метки p300-зависимого лактилирования H3K18. Сиртуины не могут эффективно удалять эти ацильные метки, поэтому эпигеном постепенно изменяется независимо от текущего уровня NAD+.

Предсказание. В сателлитных клетках (SCs) старых животных метод CUT&RUN выявляет повышенный уровень H3K18la, преимущественно в промоторах генов миогенеза и поддержания покоя. Ингибирование p300 или нокдаун LDH-A в SCs старых животных восстанавливает регенерацию и нормализует динамику экспрессии MyoD/Myogenin, а введение предшественника никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) улучшает регенерацию только при одновременном снижении лактилирования. Принудительное усиление лактилирования в SCs молодых животных (экзогенный лактат + активация p300) воспроизводит возрастное нарушение регенерации без снижения уровня NAD+.

Механизм. SIRT2 деацетилирует тубулин, компоненты, связанные с веретеном деления, и компоненты, обеспечивающие клеточную полярность. Они необходимы для локализации NUMB и асимметричного распределения митохондрий. При низком уровне NAD+ активность SIRT2 снижается, что приводит к гиперацетилированию этих субстратов. В результате апикально-базальные асимметричные деления сменяются симметричными делениями с планарной ориентацией, при которых образуются дочерние клетки, вступившие на путь дифференцировки.

Предсказание. Визуализация отдельных живых SCs старых животных на мышечных волокнах выявляет увеличение доли симметричных пар дочерних клеток Pax7+/MyoD+ и более частое симметричное наследование митохондрий (MitoTimer). Доля асимметричных делений нормализуется уже при первом делении после быстрого восстановления уровня NAD+ или активации SIRT2, а специфичная для SCs делеция Sirt2 у молодых мышей воспроизводит фенотип симметричного деления с образованием потомства, вступившего на путь дифференцировки, при нормальной скорости пролиферации.

Механизм. Покоящиеся MuSCs сохраняют готовность к быстрой активации, накапливая мРНК Myf5 с подавленной трансляцией в жидкоподобных цитоплазматических RNP-гранулах, структурную основу которых образует DDX6. В норме сигналы, вызванные повреждением, активируют цитоплазматическую TNKS1. Этот фермент использует NAD+ для поли(АДФ-рибозил)ирования неупорядоченного участка DDX6, вызывая электростатическое отталкивание, которое приводит к растворению конденсата и высвобождению мРНК Myf5 для трансляции на рибосомах. В MuSCs старых животных дефицит NAD+ препятствует поли(АДФ-рибозил)ированию DDX6, вследствие чего RNP-гранулы со временем превращаются в гидрогели, утратившие динамичность.

Предсказание. Измерение восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) и одномолекулярная флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) в MuSCs старых животных вскоре после повреждения выявят неподвижные точечные скопления DDX6, удерживающие мРНК Myf5 и лишённые цепей поли(АДФ-рибозы). При этом кратковременное фармакологическое ингибирование TNKS1 с помощью XAV939 в MuSCs молодых животных заблокирует синтез белка Myf5, не изменяя количества транскриптов Myf5.

Механизм. Для возвращения в состояние покоя необходим переход от гликолиза к окислению жирных кислот (FAO), который обеспечивают SIRT3-зависимое деацетилирование LCAD/CPT1b и SIRT1-зависимое подавление экспрессии MyoD. При низком уровне NAD+ потомки SC старых животных сохраняют гликолитический метаболизм и дифференцируются или погибают вместо того, чтобы пополнять резерв покоящихся клеток. Поэтому каждое повреждение истощает пул стволовых клеток.

Предсказание. Импульсное введение предшественника NAD+ только с 5-х по 10-е сутки после повреждения восстанавливает самообновление SC старых животных (восстановление пула Pax7+ и способности к регенерации после повторного повреждения) как минимум столь же эффективно, как постоянное введение. Введение только с момента повреждения (0 суток) до конца 2-х суток усиливает раннюю пролиферацию, но не улучшает восстановление пула. Делеция Sirt3 исключительно в SC молодых мышей должна воспроизводить характерное для старых животных нарушение пополнения резерва покоящихся клеток. При этом начальная активация SC должна сохраняться.